Nấm đỏ su-N-demethylase (ERND)Hướng dẫn sử dụng bộ dụng cụ đo hoạt tính

Phương pháp vi lượng 100T/48S

Cần lấy trước khi xét nghiệm chính thức 2-3 Một mẫu có sự khác biệt lớn để dự đoán.Xác định ý nghĩa:

Tế bào sắc tố P450 Enzyme là một nhóm enzyme chủ yếu tồn tại trong gan, trong quá trình trao đổi chất của các chất ngoại sinh, đặc biệt là sự trao đổi chất của thuốc và chất độc.Có tác dụng quan trọng. ERND ởP450 Trong hệ enzyme tương đương vớiCYP2B Phân nhóm, có liên quan chặt chẽ đến việc khử methyl hóa chuyển hóa thuốc. CYP2B VớiChất xúc tác tạo thành các chất chuyển hóa không hoạt động dễ bài tiết và có tác dụng giải độc, cũng có thể làm cho một số loại thuốc đi quaKích hoạt chuyển hóa CYP2B.

Nguyên tắc xác định:

ERNDxúc tác sự giải phóng formaldehyde của nấm mốc đỏ, thông quaĐo màu Nash để xác định hàm lượng formaldehyde. ERND 活性。

Bộ dụng cụ xác định hoạt động của Erythromycus su-N-Demethylase Dòng P450

Thành phần:

Thuốc thử 1: Bột × 1 Chai, 4Bảo quản độ C. Trước khi sử dụng100ml Nước cất hòa tan.

Thuốc thử III: Bột × 1 ống, 4Bảo quản độ C. Trước khi sử dụng1ml nước cất, hòa tan hoàn toàn.Thuốc thử IV: Bột × 1 Chai, 4Bảo quản độ C. Trước khi sử dụng0,5 ml Nước cất, hòa tan hoàn toàn.Thuốc thử 5: Bột × 1 Chai, 4Bảo quản độ C. Trước khi sử dụng, thêm nước cất4.5ml hòa tan hoàn toàn.

Chất lỏng tiêu chuẩn: Chất lỏng × 1 Chai - 20.Bảo quản độ C. Trước khi sử dụng1,5 ml EP ống, tham gia 10μlChất lỏng tiêu chuẩn, cộng 990μl nước cất, trộn đều là 0,05 mmol/LGiải pháp JIA Aldehyde tiêu chuẩn, 4℃保存。

Các thông số của sản phẩm cụ thể tùy thuộc vào các thông số nhận được hướng dẫn sử dụng sản phẩm

Tự chuẩn bị dụng cụ và vật tư:

Máy ly tâm thông thường, Máy ly tâm quá tốc độ, Súng pipet có thể điều chỉnh, Máy quang phổ/Enzyme có thể nhìn thấy, Đĩa đo thạch anh vi lượng/96 Tấm lỗ, chưng cấtNước và băng.

Chiết xuất chất lỏng enzyme thô:

1、Loại bỏ nhân, các chất đại phân tử như ty thể:Cân khoảng 0.5g Tổ chức, tham gia 1 ml Thuốc thử 1, nghiền kỹ trên băng, 10. 000g 4 ℃ từTrái tim 30min， Lấy thanh dịch, chuyển vào trong ống ly tâm siêu tốc.

2、Vi thể thô:100 000g，4℃, ly tâm60min， Bỏ đi thanh dịch.

3、Trừ các tạp chất như huyết sắc tố:Bước tới 2 Sự lắng đọng. 1 mlThuốc thử 1, sau khi đậy chặt, chấn động tan hết, 100.000gLy tâm 30min， Bỏ

Dịch thượng thanh.

4、Micro cuối cùng:Bước tới 3 Thêm thuốc thử vào lượng mưa. 0.5ml， Chấn động hòa tan đầy đủ, tức là dịch enzym thô, chờ đo. Nên đợi xét nghiệm dịch cần sử dụng cùng ngày.

Hoạt động đo lường:

1. Máy quang phổ/Máy đo Enzyme Preheat 30 phútĐiều chỉnh bước sóng đến 412 nm， Nước cất bằng không.

2. Thuốc thử 2. 37℃ Preheating trong bồn tắm nước30 phút。

3. Chăm sóc:取 0,5 ml EP ống, tham gia10μl Chất lỏng enzyme thô, 170 μl Thuốc thử II, 10μl Thuốc thử III, 10μl Nước cất, trộn đều rồi đặt37℃Bồn tắm cách nhiệt 30 phútTham gia ngay 35μlThuốc thử 5, trộn đều rồi cho vào bồn tắm đá. 5 phút; 取出Đăng nhập 35μl Thuốc thử VI, nhiệt độ phòng sau khi trộn đều

Đặt 5 phút; Nhiệt độ phòng 8000rpmLy tâm 5min； Lấy EP mớiống, tham gia 100μl Chất lỏng trong suốt, 100 μl Thuốc thử 7, sau khi trộn đều. 60 ℃ tắm nước10min， Sau đó lấy ra,Làm mát bằng nước lạnh 5 phútVới 412nmXác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớA chăm sóc.

4. Ống đo:取 0,5 ml EP ống, tham gia10μl Chất lỏng enzyme thô, 170 μl Thuốc thử II, 10μl Thuốc thử III, 10μl Thuốc thử 4, trộn đều rồi đặt vào.37℃

Bồn tắm cách nhiệt 30 phútTham gia ngay 35μlThuốc thử 5, trộn đều rồi cho vào bồn tắm đá.5 phút; 取出Đăng nhập 35μl Thuốc thử VI, nhiệt độ phòng sau khi trộn đềuĐặt 5 métin; Nhiệt độ phòng 8000rpmLy tâm 5 méttrong; lấy mới EPống, tham gia 100 μl chất lỏng làm sạch，100μl Thuốc thử 7, sau khi trộn đều. 60℃ Tắm nước10min， Sau đó lấy ra,Làm mát bằng nước lạnh 5 phútVới 412nmXác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớMột ống đo.

5. Ống tiêu chuẩn:取 0,5 ml EPống, tham gia 100μlSản phẩm tiêu chuẩn, 100 μl Thuốc thử 7, sau khi trộn đều. 60℃ Tắm nước10min， Sau đó lấy ra,Với lạnh

Nước làm mát 5 phútVới 412nm Xác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớA Ống tiêu chuẩn.

Lưu ý: Mỗi mẫu cần được chăm sóc đúng cách.

ERND Công thức tính toán hoạt tính:

a.Công thức tính toán được thực hiện bằng cách sử dụng một đĩa đo màu thạch anh vi lượng như sau:

(1).Tính theo nồng độ protein:

Định nghĩa đơn vị hoạt động: 37Ở nhiệt độ ℃ 1 nmol được xúc tác trên mỗi miligam protein mỗi phútFormaldehyde là 1 đơn vị enzyme sống

ERND Hoạt động (nmol/phút/mgprot) = C Tiêu chuẩn × V Sản phẩm tiêu chuẩn×(A) Ống đo - A Chăm sóc）÷A Ống tiêu chuẩn × bội số pha loãng÷Cpr × V

Mẫu÷T

=45 lần (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Tiêu chuẩn ống ÷ Cpr。

(2).Tính theo chất lượng mẫu:

Định nghĩa đơn vị hoạt động: 37Ở nhiệt độ ℃ 1 nmol được xúc tác trên mỗi gram mẫu mỗi phútFormaldehyde là 1 đơn vị enzyme sống

ERND Hoạt động (nmol/phút/g Trọng lượng tươi)=C Tiêu chuẩn × V Tiêu chuẩn × (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Ống tiêu chuẩn × bội số pha loãng ÷ (W × V mẫu) ÷ T

=45 lần (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Tiêu chuẩn ống÷W

CSản phẩm tiêu chuẩn: 0,05mmol / L = 50 μmol / L VTiêu chuẩn: 100 μl=1 × 10^-4 L; Pha loãng bội số: VTổng cộng ÷ V Chất lỏng=(50+850)

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: nồng độ protein lỏng enzyme thô (mg/ml)Cần xác định thêm, đề nghị sử dụng công ty này.BCA

Bộ dụng cụ đo hàm lượng protein; W: chất lượng mẫu, g；V Mẫu: Thêm thể tích chất lỏng enzyme thô, 10μl=0,01ml; T: thời gian phản ứng xúc tác(M)trong），

30 phút。

b.Sử dụng Công thức tính toán để xác định tấm 96 lỗ như sau

(1).Tính theo nồng độ protein:

Định nghĩa đơn vị hoạt động: 37Ở nhiệt độ ℃ 1 nmol được xúc tác trên mỗi miligam protein mỗi phútFormaldehyde là 1 đơn vị enzyme sống

ERND Hoạt động (nmol/phút/mgprot) = C Tiêu chuẩn × VSản phẩm tiêu chuẩn×(A) Ống đo - A Chăm sóc）÷A Ống tiêu chuẩn × bội số pha loãng÷Cpr × V

Mẫu÷T

=45 lần (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Tiêu chuẩn ống ÷ Cpr。

(2).Tính theo chất lượng mẫu:

Định nghĩa đơn vị hoạt động: 37Ở nhiệt độ ℃ 1 nmol được xúc tác trên mỗi gram mẫu mỗi phútFormaldehyde là 1 đơn vị enzyme sống

ERND Hoạt động (nmol/phút/g Trọng lượng tươi)=C Tiêu chuẩn × V Tiêu chuẩn × (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Ống tiêu chuẩn × bội số pha loãng ÷ (W × V mẫu) ÷ T

=45 lần (A) Ống đo - A Chăm sóc (A) Tiêu chuẩn ống÷W

CSản phẩm tiêu chuẩn: 0,05mmol / L = 50 μmol / L VTiêu chuẩn: 100 μl=1 × 10^-4 L; Pha loãng bội số: VTổng cộng ÷ V Chất lỏng=(50+850)

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: nồng độ protein lỏng enzyme thô (mg/ml)Cần xác định thêm, đề nghị sử dụng công ty này. BCABộ dụng cụ đo hàm lượng protein; W: chất lượng mẫu, g；V Mẫu: Thêm thể tích chất lỏng enzyme thô, 10μl=0,01ml；T: thời gian phản ứng xúc tác(M)in）， 30 phút.

Bộ dụng cụ xác định hoạt động của Erythromycus su-N-Demethylase Dòng P450