Chất anilin-4-hydroxylase (AH)Hướng dẫn sử dụng bộ dụng cụ đo hoạt tính

Phương pháp vi lượng 100 quản/48 Mẫu

Cần lấy trước khi xét nghiệm chính thức 2-3 Một mẫu có sự khác biệt lớn để dự đoán.Xác định ý nghĩa:

Tế bào sắc tốP450 Enzyme là một nhóm các đồng enzyme chủ yếu được tìm thấy trong gan và có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất ngoại sinh, đặc biệt là thuốc vàSự trao đổi chất của chất độc.AH ởP450 Trong hệ enzyme tương đương vớiCYP2E1 phân loại,CYP2E1 Không chỉ tham gia vào quá trình trao đổi chất của thuốc, mà còn xúc tác nhiều hơn.Quá trình kích hoạt các chất gây ung thư tiền trồng và các chất độc tiền trồng.

Nguyên tắc xác định:

AH xúc tác được tạo ra sau khi hydroxylation anilin 4-Aminol, tiếp tục chuyển đổi thành phenol-phức hợp indole, trong Số lượng: 630nm Chỗ có đỉnh hấp thu đặc trưng; thôngQuá xác định Số lượng: 630nmTăng tốc độ hấp thụ để tính toánAHHoạt động.

Bộ dụng cụ xác định hoạt tính anilin-4-hydroxylase (AH)

Thành phần:

Thuốc thử 1: Bột×1 chai,4℃Để dành. Tham gia trước khi sử dụng 100ml Nước cất, hòa tan hoàn toàn. Thuốc thử III: Bột×1chai,4℃Để dành. Tham gia trước khi sử dụng 10mlNước cất, hòa tan hoàn toàn. Thuốc thử IV: Bột×1chai,4℃Để dành. Tham gia trước khi sử dụng 5 mlNước cất, hòa tan hoàn toàn.

Thuốc thử 6: Bột×1 Chai (thuốc thử ăn mòn),4℃Bảo vệ khỏi ánh sáng. Tham gia trước khi sử dụng 10ml Nước cất, hòa tan hoàn toàn. Chương 7: Bột×1chai,4℃Để dành. Tham gia trước khi sử dụng 10mlNước cất được hòa tan hoàn toàn.

Chất lỏng tiêu chuẩn: Chất lỏng×1 chai,10 μmol / L，4℃Bảo vệ khỏi ánh sáng.

Các thông số của sản phẩm cụ thể tùy thuộc vào các thông số nhận được hướng dẫn sử dụng sản phẩm

Tự chuẩn bị dụng cụ và vật tư:

Máy ly tâm thông thường,Máy ly tâm quá tốc độ,Máy quang phổ có thể nhìn thấy/Máy đo Enzyme, đĩa đo màu thủy tinh vi lượng/96 Tấm lỗ, hơi nước đôi và băng.

Chiết xuất chất lỏng enzyme thô:

1、Loại bỏ nhân, các chất đại phân tử như ty thể:Cân khoảng 0.5g Tổ chức, tham gia 1 ml Thuốc thử một, nghiền kỹ trên băng,10 000g 4℃，Ly tâm 30 phútLấy thanh dịch, chuyển đến ống ly tâm siêu tốc.

2、Vi thể thô: 100 000g 4℃Ly tâm. 60 phútVứt bỏ thanh dịch.

3、Trừ các tạp chất như huyết sắc tố:Bước tới 2 Sự lắng đọng. 1 ml Thuốc thử một, sau khi đậy chặt thì tan hết chấn động,100 000g Ly tâm 30 phútBỏ đi.

Dịch thượng thanh.

4、Micro cuối cùng:Bước tới 3 Thêm thuốc thử vào lượng mưa. 0,5 mlSau khi đậy chặt, chấn động hòa tan hoàn toàn, tức là dịch enzym thô, đợi đo.

Hoạt động xác định：

1. Máy quang phổ/Máy đo Enzyme Preheat 30 phútĐiều chỉnh bước sóng đến 630 NmNước cất được điều chỉnh bằng 0.

2. Thuốc thử 3. 37℃Làm nóng trước khi tắm nước 30 phút。

3. Thuốc thử 5 đặt trước khi tắm nước đá 30 phút。

4. Ống tiêu chuẩn:取 0.5 ml EP ống, tham gia 100μl chất lỏng tiêu chuẩn,100μl Thuốc thử 6.100μl Thuốc thử 7. Để nhiệt độ phòng sau khi trộn đều. 30 phút，Hấp thụ 200μlĐối với đĩa thủy tinh nhỏ/96tấm lỗ,Số lượng: 630 nmXác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớAỐng tiêu chuẩn.

5. Chăm sóc:取 0.5 ml EP ống, tham gia 50 mL chất lỏng enzyme thô,100μl Thuốc thử 3.50 mL Nước cất, sau khi trộn đều 37℃Giữ ấm trong bồn tắm nước 30 phút；

Tham gia lại 100μl Thuốc thử 5, trộn đều rồi tắm nước đá. 5 phút，11000 vòng / phút，4℃Ly tâm. 10 phút；取 100μl Làm sạch chất lỏng, thêm mới 0.5 mlEP Ống; Tham gia lại 100μl Thuốc thử 6.100μl Thuốc thử 7. Để nhiệt độ phòng sau khi trộn đều. 30 phútHấp thụ. 200μl Đối với đĩa thủy tinh nhỏ/96 Lỗtấm,Số lượng: 630 nmXác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớ AChăm sóc.

6. Ống đo:取 0.5 ml EP ống, tham gia 50 mL chất lỏng enzyme thô,100μl Thuốc thử 3.50 mL Thuốc thử 4, sau khi trộn đều. 37℃Giữ ấm trong bồn tắm nước 30 phút；

Tham gia lại 100μl Thuốc thử 5, trộn đều rồi tắm nước đá. 5 phút，11000 vòng / phút，4℃Ly tâm. 10 phút；取 100μl Làm sạch chất lỏng, thêm mới 0.5 mlEP Ống; Tham gia lại 100μl Thuốc thử 6.100μl Thuốc thử 7. Để nhiệt độ phòng sau khi trộn đều. 30 phútHấp thụ. 200μl Đối với đĩa thủy tinh nhỏ/96 Lỗtấm,Số lượng: 630 nmXác định sự hấp thụ ánh sáng, ghi nhớ AỐng đo.

AH Công thức tính toán hoạt động：

a.Công thức tính toán được thực hiện bằng cách sử dụng một đĩa đo màu thạch anh vi lượng như sau:

（1）Tính theo nồng độ protein

Định nghĩa đơn vị hoạt động:37℃Sản xuất xúc tác mỗi miligam protein mỗi phút 1 Nmol 4-Aminol là 1 Một đơn vị enzyme sống.

AH Hoạt động(nmol / phút / mg) Prot) =C Sản phẩm tiêu chuẩn×V Sản phẩm tiêu chuẩn×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống×Pha loãng Multiple÷（Cpr × VMẫu (÷T

=2×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống÷Cpr。

（2）Tính theo chất lượng mẫu

Định nghĩa đơn vị hoạt động:37℃Mỗi gram mẫu được tạo ra xúc tác mỗi phút. 1 Nmol 4-Aminol là 1 Một đơn vị enzyme sống.

AHHoạt động(nmol / phút / g) Trọng lượng tươi)=C Sản phẩm tiêu chuẩn×V Sản phẩm tiêu chuẩn×（A Ống đo -A Chăm sóc）÷A Tiêu chuẩn ống×Pha loãng Multiple÷ (W × V) Mẫu÷T

=2×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống÷W

CSản phẩm tiêu chuẩn:10 μmol / L；VSản phẩm tiêu chuẩn:100μl = 1 × 10^-4L; Pha loãng bội số: VChống Tổng÷VChất lỏng làm sạch= 300μl ÷ 100μl = 3；Cpr: Thômạc đường ruột muqueuses digestives (Mg / ml）Cần xác định thêm, đề nghị sử dụng công ty này. BCA Bộ dụng cụ đo hàm lượng protein;W : Chất lượng mẫu;VMẫu: Thêm thể tích chất lỏng enzyme thô vào hệ thống phản ứng, 50 μl = 0,05 ml； Tthời hạn: permanant-never Lift ban (VĨNH VIỄN) (phút），30 phút。

b.Sử dụng 96 Công thức tính toán để xác định tấm lỗ như sau

（1）Tính theo nồng độ protein

Định nghĩa đơn vị hoạt động:37℃Sản xuất xúc tác mỗi miligam protein mỗi phút 1 Nmol 4-Aminol là 1 Một đơn vị enzyme sống.

AH Hoạt động(nmol / phút / mg) Prot) =C Sản phẩm tiêu chuẩn×V Sản phẩm tiêu chuẩn×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống×Pha loãng Multiple÷（Cpr × VMẫu (÷T

=2×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống÷Cpr

（2）Tính theo chất lượng mẫu

Định nghĩa đơn vị hoạt động:37℃Mỗi gram mẫu được tạo ra xúc tác mỗi phút. 1 Nmol 4-Aminol là 1 Một đơn vị enzyme sống.

AH Hoạt động(nmol / phút / g) Trọng lượng tươi) =C Sản phẩm tiêu chuẩn×V Sản phẩm tiêu chuẩn×（A Ống đo -A Chăm sóc）÷A Tiêu chuẩn ống×Pha loãng Multiple÷ (W × V) Mẫu÷T

=2×（A Ống đo -A Chăm sóc (÷A Tiêu chuẩn ống÷W

C Sản phẩm tiêu chuẩn:10 μmol / L；V Sản phẩm tiêu chuẩn:100μl = 1 × 10^-4L; Pha loãng bội số:V Chống Tổng÷VChất lỏng làm sạch= 300μl ÷ 100μl = 3；Cprmạc đường ruột muqueuses digestives (Mg / ml），Cần xác định thêm, đề nghị sử dụng công ty BCA Bộ dụng cụ đo hàm lượng protein; W : Chất lượng mẫu; VMẫu: Thêm thể tích chất lỏng enzyme thô vào hệ thống phản ứng, 50 μl = 0,05 ml； Tthời hạn: permanant-never Lift ban (VĨNH VIỄN) (phút），30 phút。

Bộ dụng cụ xác định hoạt tính anilin-4-hydroxylase (AH)