TRzol LS (Thuốc thử chiết xuất RNA mẫu lỏng)

Thuộc tính hàng hóa:

Điều kiện bảo quản:

TRzol LS được bảo quản ổn định trong 12 tháng ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên bảo quản ở 2-8 ° C.

Lưu ý quan trọng:

Có chất độc tiếp xúc với da hoặc vô ý nuốt vào, sẽ dẫn đến bỏng. Rửa sạch ngay sau khi tiếp xúc với da bằng nhiều chất tẩy rửa và nước sạch. Nếu bạn cảm thấy không khỏe, hãy gặp bác sĩ và tìm kiếm lựa chọn điều trị thích hợp với các thành phần khác.

Giới thiệu sản phẩm:

Thuốc thử TRzol LS là thuốc thử chiết xuất RNA tổng số trực tiếp từ tế bào hoặc mô. Nó duy trì tính toàn vẹn của RNA khi nó phá vỡ và hòa tan các tế bào. Ly tâm sau khi thêm chloroform, mẫu được chia thành lớp mẫu nước, lớp trung gian và lớp hữu cơ. RNA được tìm thấy trong các lớp mẫu nước. Sau khi thu thập các lớp mẫu nước ở trên, RNA có thể được phục hồi bằng cách kết tủa isopropanol. Cho dù đó là người, động vật, thực vật hay vi khuẩn, phương pháp này có tác dụng phân tách tốt hơn đối với một số lượng nhỏ và lớn các mô và tế bào. Sự đơn giản trong hoạt động của thuốc thử TRzol LS cho phép

Khi xử lý nhiều mẫu. Tất cả các hoạt động có thể được thực hiện trong vòng một giờ. RNA tổng thể được chiết xuất bởi TRzol có khả năng tránh ô nhiễm DNA và protein và có thể được sử dụng để phân tích dấu vết RNA, lai tạo điểm, sàng lọc poly (A)+, dịch in vitro, phân tích bảo vệ enzyme RNA và nhân bản phân tử. Nếu được sử dụng cho PCR, DNase I khuếch đại được khuyến khích để xử lý tổng RNA được rút ra khi hai mồi nằm trong một exon duy nhất.

Lưu ý:

Tách mẫu RNA từ một lượng nhỏ mô (1~10 mg) hoặc tế bào (10 2-10 4): 800 µl TRzol được thêm vào mô hoặc tế bào. Sau khi mẫu bị nứt, chloroform được thêm vào và thực hiện thao tác rút trong Bước 2. Trước khi kết tủa RNA với rượu isopropyl, 5~10 μg glycogen không có enzyme RNA được thêm vào làm chất mang cho lớp mẫu nước. Để giảm độ nhớt của nó, ống tiêm 26 được hút hai lần trước khi thêm chloroform để cắt DNA của bộ gen. Glycogen tồn tại trong lớp mẫu nước và đồng phân với RNA. Nó không ức chế sự tổng hợp chuỗi đầu tiên của phản ứng sao chép ngược hoặc PCR cho đến khi cô đặc đến 4 mg/ml.

Sau khi san lấp mặt bằng và trước khi thêm chloroform, mẫu có thể được bảo quản ở -60 ° C hoặc -70 ° C trong ít nhất một tháng. Kết tủa RNA hòa tan trong 75% ethanol có thể được bảo quản ít nhất một tuần ở 2-8 ° C và ít nhất một năm ở -5-20 ° C.

Đeo găng tay và bịt mắt khi rút RNA bằng TRzol LS. Tránh tiếp xúc với da và quần áo. Hoàn thành hoạt động trong tủ hút hóa chất. Tránh hít phải đường hô hấp. Nếu không có ngoại lệ, nhiệt độ phòng được duy trì trong điều kiện 15~30 ℃.

Thuốc thử tự chuẩn bị:

Cloroform, isopropyl alcohol, 75% ethanol (RNase-Free water), RNase-Free water (thêm nước vào chai thủy tinh không có enzyme RNA, DEPC đến 0,1% (V/V). Để qua đêm và khử trùng). Dung dịch SDS 0,5% (công thức nước RNase-Free) (tùy chọn).

Quy trình thực hiện:

1. Tiền xử lý mẫu a. Chất lỏng sinh học được thêm 0,75ml TRzol LS cho mỗi mẫu chất lỏng 0,25ml (huyết thanh, huyết tương, v.v.) và thổi mẫu chất lỏng vài lần bằng súng mẫu để giúp phá vỡ các tế bào trong mẫu. Ít nhất 0,75 ml TRzol LS được thêm vào mỗi 5~10 × 10 6 tế bào. Đối với các mẫu có chứa các chất gây ô nhiễm cao như mẫu máu nguyên chất, việc chiết xuất có thể được bắt đầu bằng cách pha loãng gấp đôi với nước khử trùng theo tỷ lệ 1: 1. Tỷ lệ khối lượng cuối cùng của TRzol LS và mẫu lỏng luôn là 3: 1. b. mô trộn mẫu mô bằng kính hoặc máy san lấp mặt bằng mạnh mẽ, mỗi 50~100 mg mô hoặc 0,25 ml đình chỉ mô cộng với 0,75 ml TRzol LS. Nói chung, khối lượng mô 50~100mg phải nhỏ hơn 0,25ml, nếu khối lượng mô mẫu nhỏ hơn 0,25ml, thêm nước khử trùng để điều chỉnh khối lượng mô mẫu đến 0,25ml để đảm bảo tỷ lệ thể tích là 3: 1. c. Các tế bào phát triển một lớp trực tiếp thêm 0,3ml-0,4ml TRzol LS hòa tan tế bào vào một tấm nuôi cấy có đường kính 3,5 cm, thổi bằng súng mẫu để giúp các tế bào hòa tan đầy đủ. Lượng TRzol LS cần thiết được xác định dựa trên diện tích của tấm nuôi cấy, không phải số lượng tế bào (cộng 0,3-0,4 ml mỗi 10cm2). Không cần phải thêm nước vào chất nứt vì TRzol LS đã được pha loãng đầy đủ với dung dịch nuôi cấy còn sót lại gắn vào đĩa nuôi cấy. d. Tế bào phát triển lơ lửng kết tủa tế bào bằng cách ly tâm. Các tế bào lysis được thổi liên tục bằng pipet trong thuốc thử TRzol LS. Mỗi 5~10 × 10 6 tế bào động vật, tế bào thực vật hoặc nấm men hoặc 0,75 ml TRzol LS cho mỗi 1 × 10 7 vi khuẩn. Thể tích mẫu được điều chỉnh đến 0,25 ml bằng nước khử trùng như trong bước b. Nên tránh rửa tế bào trước khi thêm TRzol LS, vì điều này sẽ làm tăng khả năng phân hủy mRNA. Phá vỡ một số nấm men và vi khuẩn có thể yêu cầu sử dụng máy san lấp mặt bằng. 2. Giai đoạn phân lập ủ mẫu homogenium trong 5 phút ở 15-30 ° C để phân hủy nucleosome. Mỗi 0,75 ml TRzol LS cộng với 0,2 ml chloroform. Đóng nắp ống mẫu, lắc mạnh ống bằng tay trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2~15 phút. Đóng băng ly tâm ở tốc độ cao trong 15 phút với lực ly tâm không quá 12.000 × g ở 2~8 ° C. Hỗn hợp ly tâm được chia thành ba lớp: lớp dưới - lớp chloroform, lớp giữa, lớp mẫu nước không màu ở trên. RNA tồn tại trong các lớp mẫu nước, không có ngoại lệ. Các lớp mẫu nước có công suất khoảng 70% công suất TRzol LS cộng thêm.

2. Lượng mưa của RNA chuyển lớp mẫu nước vào một ống nghiệm sạch, nếu muốn tách DNA và protein, lớp hữu cơ và lớp trung gian cũng phải được giữ lại. RNA được kết tủa bằng cách trộn một lớp mẫu nước với rượu isopropyl. Mỗi 0,75ml TRzol LS tương ứng với 0,5ml rượu isopropyl. Các mẫu hỗn hợp được ủ trong 10 phút ở 15-30 ° C và đóng băng ly tâm ở tốc độ cao trong 10 phút với lực ly tâm không quá 12.000 × g ở 2-8 ° C. Sự kết tủa RNA thường không nhìn thấy trước khi ly tâm, sau khi ly tâm, một kết tủa dạng keo được hình thành để gắn vào thành ống và đáy ống.

3. Sự trôi dạt của RNA di chuyển ra khỏi hệ thống treo trên. Kết tủa RNA được rửa sạch một lần với 75% ethanol (công thức nước RNase-Free), cộng với ít nhất 1 ml ethanol 75% cho mỗi 0,75 ml TRzol LS. Dao động xoáy trộn mẫu và đóng băng ly tâm ở tốc độ cao trong 5 phút với lực ly tâm không vượt quá 7.500 × g ở 2~8 ° C.

4. Nhiệt độ phòng tái hòa tan của RNA đơn giản làm khô kết tủa RNA, không ly tâm làm khô RNA trong ống chân không. Điều đặc biệt quan trọng là việc không để RNA kết tủa khô sẽ làm giảm đáng kể độ hòa tan của nó. Một mẫu RNA hòa tan một phần có tỷ lệ OD260/OD280<1,6. Nước RNase-Free hoặc dung dịch SDS 0,5% được lấy bằng pipet để hòa tan RNA (tránh SDS nếu RNA sau này được sử dụng trong phản ứng cắt enzyme). RNA cũng được tái hòa tan bởi 100% formamide (loại bỏ ion) và được giữ ở -70 ° C.

Các bước và biện pháp phòng ngừa PCR cơ bản?

I. Nguyên tắc thí nghiệm

PCR là một phương pháp nhân tạo khuếch đại chọn lọc DNA trong ống nghiệm, tương tự như sao chép DNA trong một sinh vật. Sao chép DNA trong một sinh vật đòi hỏi các mẫu, mồi, DNA polymerase, DNA decyclase, dNTP; Các phản ứng PCR trong ống nghiệm cũng đòi hỏi các thành phần tương tự, bao gồm khuôn mẫu, mồi, PCR Buffer, Taq enzyme, dNTPs。 Trong đó mồi là một chuỗi cụ thể được thiết kế nhân tạo để đạt được sự khuếch đại của một vị trí cụ thể; PCR Buffer cung cấp một môi trường đệm đáp ứng; Quá trình phản ứng cũng giống như trong sinh vật, DNA mở ra hai sợi, dẫn vật kết hợp với khuôn mẫu, kéo dài thành chuỗi mới. Các quá trình này được thực hiện bên trong cơ thể bằng cách giải mã DNA, trong khi bên ngoài cơ thể bằng cách kiểm soát nhiệt độ phản ứng. Như thường được sử dụng 94 ℃ biến đổi mẫu DNA để mở chuỗi đôi, ở nhiệt độ ủ dẫn kết hợp với mẫu, cuối cùng ở 72 ℃ để hoàn thành việc mở rộng, và lặp đi lặp lại quá trình này có thể đạt được một sự mở rộng lớn của các đoạn DNA cụ thể. Đến khi bắt đầu chu kỳ thứ ba, các phân tử DNA giống như các phân đoạn DNA đích được tạo ra, tiếp tục tuần hoàn tạo ra gấp đôi số mũ của các phân đoạn DNA đích.

Trong giai đoạn sau của quá trình khuếch đại, do tích lũy sản phẩm, phản ứng ban đầu được khuếch đại theo cấp số nhân trở thành một đường cong phẳng, sản phẩm không còn tăng rõ rệt với số lượng chu kỳ, được gọi là hiệu ứng nền tảng. Giai đoạn Plateau (Plateau) cho phép nồng độ thấp, các sản phẩm không đặc hiệu ban đầu được tạo ra do sai phối, tiếp tục mở rộng đáng kể đến mức cao hơn. Do đó, số lượng chu kỳ nên được điều chỉnh thích hợp để kết thúc phản ứng trước thời kỳ nền tảng và giảm các sản phẩm không đặc hiệu. Số chu kỳ cần thiết để đạt đến giai đoạn Plateau (Plateau) phụ thuộc vào bản sao của mẫu trong mẫu.

II. Thành phần chính

1. Mẫu có thể ở nhiều dạng, chủ yếu bao gồm DNA bộ gen, DNA plasmid, DNA bộ gen mang virus, sản phẩm PCR, cDNA, v.v., nhưng không thể là RNA. Đối với các loại mẫu khác nhau, sự khác biệt chính là thời gian tiền biến tính và số lượng mẫu. Nói chung, đối với DNA gen lớn thời gian tiền biến 10 phút là đủ, plasmid DNA2min, mang virus DNA tiền biến 2 phút, sản phẩm PCR tiền biến 2 phút là đủ.

Lưu ý rằng cDNA là DNA sợi đơn, nhưng vẫn có thể làm khuôn cho PCR, ngoại trừ trong vòng đầu tiên, chỉ có một mồi kết hợp để tổng hợp một sợi khác. Bắt đầu từ vòng thứ hai, cả hai mồi đều liên kết với một vị trí cụ thể, cho phép kết nối với PCR thông thường. Tuy nhiên, RNA đơn sợi không thể mở rộng PCR vì phản ứng PCR là DNA polymerase, chỉ có thể xác định chuỗi DNA một cách đặc biệt.

2. Đối với số lượng khuôn mẫu, khối lượng chung của DNA hệ thống 25ul là 50100ng. Đối với DNA bộ gen do cấu trúc phức tạp hơn, nồng độ chiết xuất cũng có xu hướng lớn hơn, để ngăn chặn nồng độ quá lớn ảnh hưởng đến PCR, cần phải pha loãng gradient DNA chiết xuất. Nếu không nồng độ quá cao có thể gây ra sự khuếch đại không đặc hiệu. Đối với các sản phẩm plasmid và PCR do cấu trúc đơn giản và nồng độ chiết xuất thường thấp, không cần pha loãng.

Những vấn đề cần lưu ý trong thí nghiệm PCR là gì?

Không có giá trị ct

Kết quả kiểm tra gặp phải tình huống không có giá trị CT, kiểm tra xem có vấn đề sau đây hay không:

Không đủ số chu kỳ (thường không vượt quá 45 chu kỳ, không chỉ tăng giá trị nền, định lượng cũng không chính xác);

2, chương trình PCR được thiết lập sai, các bước phát hiện tín hiệu huỳnh quang là sai. Thông thường SG phương pháp sử dụng 72 ℃ mở rộng thu thập, quy tắc TaqMan thường thu thập tín hiệu ở cuối ủ hoặc mở rộng, ngoài việc thu thập huỳnh quang được chọn hay không;

3. Dẫn vật hoặc thăm dò suy thoái. Có thể phát hiện sự xuống cấp của mồi và đầu dò bằng điện di PAGE;

4, kích thước khuôn mẫu có thể bị suy giảm hoặc mẫu trên không đủ (không quá 500ng, theo hướng dẫn của bộ dụng cụ), mẫu ở nồng độ không xác định nên bắt đầu từ nồng độ cao nhất của mẫu pha loãng hàng loạt; Nếu sự suy thoái của mẫu xảy ra, cần xem xét sự ra đời của các tạp chất trong việc chuẩn bị mẫu và tình trạng đóng băng và tan chảy lặp đi lặp lại, đề nghị các mẫu mẫu được lưu trữ với số lượng nhỏ để tránh đóng băng và tan chảy lặp đi lặp lại;

5, Đầu dò mồi có phù hợp hay không (đặc biệt là các mồi vượt qua các intron để đảm bảo khuếch đại DNA bộ gen; Giá trị Tm của mồi trên và dưới 4 ℃ cũng sẽ ảnh hưởng đến sự mở rộng).

Giá trị CT quá muộn

Trong định lượng tương đối, giá trị Ct thường được kiểm soát tốt hơn giữa 1525, nếu định lượng tuyệt đối, đối với mẫu có số lượng bản sao thấp, giá trị Ct sẽ tăng lên, nhưng nói chung không nên vượt quá chu kỳ 40, nếu không định lượng không chính xác.

Do đó, việc xác định liệu giá trị Ct có xuất hiện quá muộn hay không là điều bất thường và cần được thực hiện theo thiết kế và mục đích thí nghiệm cụ thể.

1. Hiệu suất mở rộng thấp. Tỷ lệ dẫn vật hoặc dẫn vật và thăm dò không thích hợp, cần tiến hành tối ưu hóa; Thiết kế mồi hoặc đầu dò không hợp lý và cần thiết kế lại;

2, chương trình PCR là không phù hợp, thay vào đó sử dụng phương pháp ba bước để phản ứng, hoặc tối ưu hóa nhiệt độ ủ/mở rộng, có thể làm giảm nhiệt độ ủ thích hợp; ủ/kéo dài thời gian ngắn (có thể kéo dài 10 giây trong điều kiện thời gian khuyến nghị);

3, nồng độ MgCl2 không phù hợp, tăng nồng độ ion magiê, v.v. Sự suy thoái hoặc không đủ số lượng mẫu của các thành phần phản ứng khác nhau của PCR;

Sản phẩm PCR quá dài. Thiết kế sản phẩm PCR trên 500bp;

5. Chất ức chế tồn tại trong khuôn mẫu. Kiểm tra PCR với mẫu có độ tinh khiết cao hoặc pha loãng mẫu.

Sản phẩm công ty đang bán: