pBLUE-T Carrier Clone Kit T4 nguyên tắc Carrier và những người khác

NamepBLUE-T Carrier Clone Kit T4 nguyên tắc Carrier và những người khác

pBLUE-T Carrier Clone Kit Bộ dụng cụ

Số danh mục: 42014

Bộ thành phần, lưu trữ, ổn định:

Lưu trữ 20 ℃, trong vòng 6 tháng không ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng.

Các thông số của sản phẩm cụ thể tùy thuộc vào các thông số nhận được hướng dẫn sử dụng sản phẩm

Giới thiệu sản phẩm:

Nhiều DNA polymerase nhiệt độ cao, chẳng hạn như Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase và các sản phẩm PCR khác được khuếch đại ở mức 3 '-Kết thúc với một cơ sở A nhô ra, các sản phẩm PCR như vậy có thể được sử dụng với 3 '-Sau khi kết thúc có một phương tiện truyền dẫn với một cơ sở T nổi bật thuận tiện để nhân bản. Chất mang pBLUE-T có nguồn gốc từ plasmid pBlueScript II SK (+) với trình tự thích hợp được thêm vào vị trí tiếp tuyến của enzyme EcoRI, được cắt bởi enzyme XCM I để tạo ra một cơ sở T chưa ghép nối trực tiếp ở cuối 3'của nó, do đó có hiệu quả tái tổ hợp cao hơn. Hai vị trí ECOR I được thiết kế độc đáo ở cả hai đầu của vị trí chèn vector pBLUE-T cho phép phân đoạn chèn có thể được phát hiện bằng cách cắt đơn enzyme ECOR I rẻ tiền và hiệu quả; Đồng thời, vectơ pBLUE-T không chứa các vị trí endoenzyme hạn chế NdeI hoặc NcoI và có thể được sử dụng để nhân bản các gen có chứa các vị trí enzyme được mô tả ở trên. Ngoài ra, hệ thống kết nối tàu sân bay của công ty còn có nền thấp (đốm xanh nhỏ hơn 10%), tỷ lệ tổ chức lại cao (hơn 90% trong đốm trắng có đoạn chèn), có thể kết nối nhanh chóng và các đặc điểm khác. Thông tin kỹ thuật liên quan đến chất mang pBLUE-T được liệt kê ở cuối hướng dẫn này, trình tự đầy đủ có thể tham chiếu đến trình tự pBlueScript II SK (+), chỉ khác một chút ở vị trí cắt enzyme đa dòng của nó.

Giải trình tự có thể được thực hiện với các mồi khởi động T3, T7 và mồi giải trình tự chung M13 (xem biểu đồ sau)

Các bước hoạt động:

1. Chuẩn bị cho phản ứng kết nối:

Việc sản phẩm PCR có được tinh chế hay không phụ thuộc vào chất lượng của sản phẩm khuếch đại. Nếu sản phẩm PCR rất sạch, phản ứng kết nối có thể được thực hiện trực tiếp mà không cần tinh chế. Nhưng nếu nó là một sản phẩm PCR với plasmid làm khuôn mẫu, nó phải được tinh chế, và plasmid khuôn mẫu có thể cũng hình thành các đốm trắng. PCRCác sản phẩm có thể được phân lập bằng điện di gel agarose. Bộ dụng cụ phục hồi tinh khiết nhanh các sản phẩm DNA do công ty sản xuất.Các đoạn DNA trên 0bp được tái chế tốt.

Các sản phẩm PCR được khuếch đại bởi Taq, Tth, AmpliTaq, KlenTaq DNA polymerase, tất cả đều có một điểm 3 nổi bật ở cuối.-A。 Với3’-Các sản phẩm PCR ở cuối A có thể được nhân bản trực tiếp với các vectơ pBLUE-T. với 3'®5'exceplase hoạt động DNA polymerase (High Fidelity Enzyme) khuếch đại sản phẩm PCR là kết thúc bằng phẳng, để nhân bản sản phẩm PCR kết thúc bằng phẳng này, nên tốt dòng 3'-Kết thúc cộng với một công việc.

2. Phản ứng kết nối thông thường:

1) Trong một tiêu chuẩn 10mKết nối với hệ thống phản ứng, thêm 1mL30% của pblue-tVật dẫn, Xml PCRsản phẩm (trong trường hợp thông thường, không cần thiết phảiPCRSản phẩm được định lượng chính xác, tối ưu hóa tỷ lệ mol của sản phẩm PCR và chất mang nói chung đến 2: 1~10: 1 có thể nhận được kết quả tốt, khuyến nghị 3: 1),1ml 10´liên kết Buffervà 0,5 - 1.mL(DNA T4 của 2.5-5 Weiss UnitsLigase， Phần còn lại dùng nước bổ sung. Phản ứng được thực hiện theo hệ thống sau:

Kết quả tìm kiếm cho "T4 DNA Ligase"

2) 16 ℃ kết nối qua đêm (thường có thể được hoàn thành trong thiết bị PCR).

Thông thường đề nghị kết nối 16 ℃ qua đêm (10)mlSố lượng kết nối tiêu chuẩn hệ thống là 2,5đơn vị Weiss(Có thể nhận được nhiều chuyển hóa nhất). Tuy nhiên, hệ thống này có PEG Enhancer có thể cải thiện hiệu quả kết nối gấp nhiều lần.，Trong trường hợp có hàm lượng enzyme cao (10)mlHệ thống khuyến nghị lượng enzyme kết nối là 5.đơn vị WeissKết nối 16 ℃ trong 30 phút có thể đạt được yêu cầu nghiên cứu chung.

3)Băng được làm lạnh và sau đó được chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ° C.

3. Phản ứng kết nối nhanh:

1) Phản ứng được thực hiện theo hệ thống sau:

Kết quả tìm kiếm cho "T4 DNA Ligase"

2) Kết nối 22 ℃ trong 5-10 phút (thường có thể được thực hiện trong thiết bị PCR).

2 ´Quick Ligation Buffer đã bao gồm tất cả các thành phần kết nối nhanh được tối ưu hóa, thường được khuyến nghị cho kết nối 22 ℃ trong 10 phút.（10mlSố lượng enzyme kết nối hệ thống là 5đơn vị WeissCác kết nối dài có thể kéo dài đến 30 phút) thường có kết quả hài lòng. Ngoài ra, hệ thống này cũng có thể được kết nối ở 16 ℃ trong 30 phút (10)mlSố lượng enzyme kết nối hệ thống là 5Weiss Units đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu chung.

3)Băng được làm lạnh và sau đó được chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ° C.

4. Chuyển đổi:

ð50-100ml Tế bào trạng thái cảm nhận, đặt trên băng, sau khi tan băng xong phủi nhẹ vài lần để treo tế bào đều.

ðTham gia 4-5mlChất lỏng kết nối (tối đa có thể được thêm vào, miễn là thể tích không vượt quá 1/10 thể tích tế bào cảm nhận), trộn đều nhẹ nhàng. Đặt trên băng30 phút. 42 ℃ Nhiệt độ bồn tắm 90Giây. Đặt trên băng 2~3 phút.

ðCộng 500mMôi trường LB hoặc SOC (không có kháng sinh), 37 ℃ 150 vòng/phútBồi dưỡng chấn động 60 phút.

ð200.mlVi khuẩn được sử dụng trước 16ml 50mg / ml IPTGvà 40ml 20 mg/ml X-gal tráng trên một tấm ampicin.

Lượng vi khuẩn phủ được điều chỉnh phù hợp dựa trên hiệu quả kết nối và tỷ lệ thụ thể của tế bào thụ thể, nếu nhân bản dự kiến ít hơn, một phần của dịch nuôi cấy có thể được hút bằng ly tâm (4.000 vòng/phút, 2 phút), để lại một lượng thích hợp của vi khuẩn đình chỉ sau khi lấy toàn bộ hoặc bôi vừa phải trong một tấm phẳng (bôi dung dịch vi khuẩn còn lại có thể được đặt ở 4 độ để bảo quản, ngày thứ hai nếu số lượng vi khuẩn chuyển đổi ít, có thể bôi toàn bộ dung dịch vi khuẩn còn lại lên một tấm nuôi cấy mới).

ðCác tấm phẳng được đặt theo hướng tích cực ở 37 ° C trong 1 giờ để hấp thụ chất lỏng dư thừa, sau đó được trồng ngược qua đêm.
5 Sàng lọc:

1). Sàng lọc màu xanh trắng cho Translator:

Khi một đoạn DNA ngoại lai được chèn vào pBLUE-TSau đó, do nguồnSự hiện diện của trình tự axit nucleic của DNA làm thay đổi mã hóa của gen LacZ và do đó ảnh hưởng đến sản phẩm của nó.b-Namea-Hoạt động của các phân đoạn, do đó các bản sao tái tổ hợp xuất hiện màu trắng trên các tấm X-gal/IPTG thay vì màu xanh trên các bản sao không tái tổ hợp. Đôi khiChèn đoạn không ảnh hưởngHộp đọc gen lacZ, hoặc các mảnh chèn quá nhỏ, trong trường hợp này thuộc địa (nhân bản tái tổ hợp) xuất hiện màu xanh nhạt hoặc các đốm màu xanh nhạt ở trung tâm của thuộc địa và vòng ngoài màu trắng (mắt cá màu xanh). Chọn các thuộc địa màu trắng hoặc màu xanh nhạt phát triển trên tấm IPTG/X-gal, chọn môi trường lỏng có chứa ampicillin bằng tăm và nuôi qua đêm ở 37 ° C.
2). Xác định chất chuyển hóa:

a.Plasma được chiết xuất bằng dịch nấm của các thuộc địa màu trắng được nuôi cấy ở trên, được cắt bằng monoenzyme ECOR I hoặc bằng các enzyme thích hợp khác, và điện di gel agarose kiểm tra kích thước của mảnh để xác định xem nó có chứa mảnh mục đích hay không.

b.Chọn các thuộc địa màu trắng để xét nghiệm PCR trực tiếp (xem bản sao phân tử 3 hoặc tham khảo ý kiến chúng tôi)

c) Sử dụng các mồi khởi động T3 và T7 hoặc các trình tự mồi thích hợp khác để xác định xem có nhân bản mục đích hay không.

Làm thế nào để tính toán số lượng sản phẩm PCR cần thiết trong phản ứng kết nối?

Nói chung, tối ưu hóa tỷ lệ mol của sản phẩm PCR và chất mang đến 2: 1~10: 1 (khuyến nghị 3: 1) cho kết quả tốt, có thể sử dụng công thức sau:

[Lượng vectơ được thêm vào (ng) × Kích thước mảnh chèn (kb) ÷ Kích thước vectơ (kb)] × Tỷ lệ mol của mảnh chèn và mảnh mang=Lượng mảnh được chèn vào (ng) Ví dụ: Tỷ lệ mol của mảnh chèn và kết nối vectơ là 3: 1, chẳng hạn như khi người mang 40ng được thêm vào phản ứng kết nối và kích thước mảnh chèn là 1000bp, tại thời điểm đó, phần chèn nên được thêm vào là [40ng vectơ × 1kb mảnh chèn ÷ 2,984kb vectơ] × 3/1=40,2ng.

pBLUE-T Carrier Clone Kit T4 nguyên tắc Carrier và những người khác