Một bước Seamless Cloning Kit

NameMột bước Seamless Cloning Kit

Bộ sao chép liền mạch một bước (Mảnh đơn)

Số thư mục:42111

Khối lượng đóng gói:

Lưu trữ sản phẩm:-20°C. Bảo quản, tránh đông lạnh nhiều lần

Các thông số của sản phẩm cụ thể tùy thuộc vào các thông số nhận được hướng dẫn sử dụng sản phẩm

Mô tả sản phẩm:Bộ dụng cụ nhân bản liền mạch một bước không phụ thuộc vàoT4Kết nối enzyme, không bị giới hạn bởi các vị trí cắt enzyme của các phần mang và mục đích, trong khi phương pháp tái tổ hợp trực tiếp với các phần chồng chéo, sử dụng sự kết hợp enzyme đặc biệt có thể tuyến tính hóa các phương pháp tùy ý của vectơ và cả hai đầu của nó có16-25bpVùng chồng chéoPCRCấu trúc lại kết nối, có thể30Thực hiện trong vòng vài phút.AKết thúc hoặc kết thúc phẳngPCRCác đoạn sản phẩm được nhân bản liền mạch và hiệu quả đến bất kỳ vị trí nào của tàu sân bay.

Tính năng sản phẩm:

1. 30Một phút có thể là một50bp-15kb PCRPhân đoạn khuếch đại (Flat)/ AKẾT THÚC) Nhân bản được chèn vào bất kỳ vị trí nào của tàu sân bay bất kỳ.

2.Không phụ thuộc vào sự sẵn có của các vị trí cắt enzyme của vectơ và mảnh chènKết thúc hòa bình/粘性末端的限Bạn có thể nhân bản tại bất cứ vị trí nào.

3. Nhân bản liền mạch, các điểm chèn không giới thiệu các chuỗi cơ sở không mong muốn.

4. Không phụ thuộc vào kết nối và phosphatase, hiệu quả cao, chính xác, tỷ lệ nhân bản dương tính có thể đạt được95%Trên này.

Sơ đồ nguyên tắc bộ dụng cụ nhân bản liền mạch một bước:

Linear Carrier và chènDNAChuẩn bị các mảnh:

A: Chuẩn bị tàu sân bay tuyến tính

(1).Nguồn cắt enzyme:Enzyme cắt được chất mang tuyến tính, đầu phẳng hoặc đầu dính, cắt đơn hoặc cắt đôi đều có thể, sau khi cắt keo thu hồi.

Lưu ý: Không có chuỗi trong hệ thống phản ứng nhân bản liền mạch một bướcDNAKết nối enzyme, không xảy ra phản ứng tự kết nối vận chuyển. Do đó, ngay cả các vectơ tuyến tính được chuẩn bị theo phương pháp cắt đơn enzyme cũng không cần xử lý triệt để. Nhân bản dương tính giả xuất hiện sau khi chuyển đổi sản phẩm tái tổ hợp(Không chèn đoạn)Nó được hình thành bởi các enzym không thể cắt hết các chất dẫn vòng chưa tuyến tính hóa. Chúng tôi đề nghị thu hồi keo sau khi cắt enzyme có thể giảm tỷ lệ chất mang không tuyến tính này xuống mức tối đa di.

(2).Đảo ngượcPCRNguồn:Hi-Fi được đề xuấtDNAPolymerase (Số hàng:P517-05hoặcP812-05) Chuẩn bị, nếu dải mở rộng duy nhất có thể vượt quaPCRThông số sản phẩm Thông tin sản phẩm Bình Luận(DC012-50) Lấy phương tiện truyền tải, nếu không sẽ được thu hồi bằng keo.DC011-50)Lấy tàu sân bay.

Lưu ý: Đảo ngượcPCRMẫu plasmid cũng là một chất mang phi tuyến tính và cũng có thể dẫn đến các bản sao dương tính giả (không có mảnh chèn), do đóPCR-Hiển thị manipulator (PCRSản phẩm) Sử dụng trước khi tinh chếDpn IEndozyme tiêu hóa mẫu plasmid, có thể làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính. Nhưng nói chung, sau khi thu hồi keo đã đủ để giảm tỷ lệ chất mang không tuyến tính này xuống mức tối đa di, do đó đảo ngượcPCRNguồn gốc của phương tiện truyền tải tuyến tính chúng tôi cũng đề nghị tái chế keo.

B: ChènDNAChuẩn bị Fragment

(1).Nguyên tắc chung của thiết kế mồi nhân bản liền mạch một bước là: bằng cách5’Kết thúc giới thiệu một chuỗi tương đồng đầu cuối của tàu sân bay nhân bản tuyến tính sao cho các sản phẩm khuếch đại phân đoạn chèn5’và3’Kết thúc cùng với một chuỗi nhất quán hoàn chỉnh tương ứng với hai kết thúc của tàu sân bay clone tuyến tính(16 bp)～20 bp)。

(2).Thiết kế mồi phân đoạn chèn: Một mồi nhân bản bao gồm một chuỗi mồi cụ thể của đoạn chèn và một chuỗi chồng chéo.

Nhân bản chuyển tiếp mồi(5’-3’): Vận chuyển tuyến tính chuyển tiếp16-25 ntChuỗi vùng chồng chéo(3"Kết thúc đếm)+-Hiển thị manipulator (18-25 nt）

Nhân bản ngược mồi(5’-3’): Đảo ngược tàu sân bay tuyến tính16-25 ntChuỗi vùng chồng chéo(3"Kết thúc đếm)+-Hiển thị manipulator (18-25 nt）

Lưu ý: Cơ sở kiềm của vùng chồng chéo ít nhất16 bpVà giữa nhiều vùng chồng chéo.TmGiá trị phải phù hợp và60 ° C (cặp AT = 2 ° C và cặp GC = 4 ° C)Nếu không, bạn có thể kéo dài số lượng cơ sở đến khi phù hợp yêu cầu.

Chiều dày mối hàn góc (5"Nổi bật,3B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)3Tình huống, ý bảo như sau:

Cả hai đầu của tàu sân bay tuyến tính hóa do cách tuyến tính (ví dụ: cắt đơn enzyme, cắt kép, đảo ngược)PCR) Khác nhau, có thể là bất cứ sự kết hợp nào của hai trong ba cấu trúc cuối cùng trên, nguyên tắc thiết kế dẫn đặc biệt của đoạn chèn vào tuân theo nguyên tắc thiết kế dẫn chung là được.

Khi tính toán nhiệt độ ủ chì khuếch đại, chỉ cần tính toán trình tự khuếch đại đặc hiệu genTmCác giá trị, các chuỗi đồng nguồn ở đầu của máy mang không nên tham gia tính toán.

(3).Lựa chọn enzyme: Độ trung thực cao được khuyến nghịDNApolymerase hoặcTrộn PCR(Số hàng:P517-05hoặcP814-05）。

(4).Điều kiện phản ứng: thường được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng polymerase cụ thể.

(5).Phân đoạn chèn tinh khiết

l Tùy chọn: Nếu mảnh vỡ có nguồn gốc từ mẫu plasmid và plasmid này có cùng sức đề kháng với chất mang tái tổ hợp, được sử dụng trước khi tinh chếDpn IEndozyme tiêu hóa mẫu plasmid, làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính.

l Nếu chỉ có một mảnh thì đề nghịPCRThiết bị vớt váng dầu mỡ cho xử lý nước thải -PetroXtractor - Well Oil Skimmer (DC012-100) Thanh lọc các đoạn.

l Nếu có sự khuếch đại không đặc hiệu, bộ dụng cụ tái chế bằng keo được khuyến nghị (số hàng:DC011-100)Tái chế các mảnh.

l Sử dụng phương pháp này để nhân bản, để tuyến tính hóa chất mang enzyme cắt vị trí sẽ bị thiếu khi nối, nếu có yêu cầu nghiêm ngặt về vị trí enzyme cắt, đề nghị chú ý đến sự lựa chọn của vị trí enzyme cắt, khi cần thiết có thểGiữa trình tự vùng chồng chéo và trình tự gen cụ thể của mồi nhân bản chuyển tiếp và ngượcTăng cơ sở bị thiếu để khôi phục vị trí cắt enzyme ban đầu (xem ví dụ sau).

l Nếu plasmid tái tổ hợp được sử dụng để biểu hiện protein, hãy chú ý đến khung đọc mã khi thiết kế mồi, biểu hiện protein và tinh chế các trình tự cần thiết (như promoter,RBSChuỗi, codon bắt đầu, codon kết thúc, nhãn protein, v.v.) không bị phá hủy.

REFERENCES [Tên bảng tham chiếu] (EcoR Icắt enzyme):

Như hình trên, người vận chuyển được cung cấp bởiEcor IEnzyme cắt, hình thành5"Kết thúc nổi bật:

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, từ3Bắt đầu tính toán, trở lạiSố lượng: 16bp-25bp(Ví dụ này được sử dụng20 bp(Cuối cùng chồng lấp cùng một chuỗi), thêm vào trước chuỗi dẫn đặc biệt của đoạn mục đích là được. Đảm bảo vùng chồng chéoTmGiá trị phù hợp và60 ° C (cặp AT = 2 ° C và cặp GC = 4 ° C)。

Chuyển tiếp mồi cụ thể như sau:5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Ghi chú: Sau khi thiết kế dẫn trên hoàn thành kết nối nhân bản,EcoR ICắt enzyme sẽ biến mất (cắt enzyme không được giữ lại).

Nếu cần giữEcoR IVị trí cắt enzyme, cần ở cuối tàu sân bay20 bpBổ sung những gì còn thiếu giữa các chuỗi chồng chéo và các chuỗi mồi cụ thể của phân đoạn đíchEcoR IXác định chuỗi các bitaattcSau khi hoàn thành kết nối nhân bản,EcoR IVị trí cắt enzyme vẫn tồn tại (giữ lại vị trí cắt enzyme).

Cụ thể như sau:5' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Tranh Luận/Thảo Luận (Debate)Hind IIIcắt enzyme):

Như hình trên, người vận chuyển được cung cấp bởiHind IIIEnzyme cắt, hình thành5"Kết thúc nổi bật:

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, từ3Bắt đầu tính toán, trở lạiSố lượng: 16bp-25bp(Ví dụ này được sử dụng20 bp(Cuối cùng chồng lấp cùng một chuỗi), thêm vào trước chuỗi dẫn đặc biệt của đoạn mục đích là được. Đảm bảo vùng chồng chéoTmGiá trị phù hợp và60 ° C (cặp AT = 2 ° C và cặp GC = 4 ° C)。

Reverse mồi cụ thể như sau:5'CTGCCATCGGATCGTGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

Ghi chú: Sau khi thiết kế dẫn trên hoàn thành kết nối nhân bản,Hind IIICắt vị trí sẽ biến mất (không giữ lại vị trí enzyme).

Nếu cần giữHind IIIVị trí cắt enzyme, cần ở cuối tàu sân bay20 bpBổ sung những gì còn thiếu giữa các chuỗi chồng chéo và các chuỗi mồi cụ thể của phân đoạn đíchHind IIIXác định chuỗi các bitAGCTT，Hind IIIVị trí cắt enzyme vẫn tồn tại (giữ lại vị trí cắt enzyme).

Cụ thể như sau:5' CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Các bước hoạt động của phản ứng clone liền mạch:

Chú ý:Hỗn hợp sao chép 2 × OneStepChứa chất tăng cường kết nốiPEGRất sền sệt, khi lấy từ tủ lạnh ra nhiệt độ thấp thì càng sền sệt, có thể đặt trong lòng bàn tay đông lạnh vài phút nâng cao nhiệt độ là có thể giảm độ sền sệt (không ảnh hưởng đến chất lượng), trộn đều, trong nháy mắt ly tâm thu thập được đáy ống.

1. REFERENCES [Tên bảng tham chiếu] (PCRỐng được chế biến ở nhiệt độ phòng)

* Tàu sân bay thường được sử dụng20-50 ngChèn các mảnh ghép vào so với mol của tàu sân bay.2:1-3:1Tốt nhất; Nếu mảnh ghép nhỏ hơn200bpChèn các mảnh ghép hơn là mol của phương tiện truyền tải.5:1。

2. Nhẹ nhàng trộn đều, trong50°CPhản hồi15phút (có thểPCRSau khi kết thúc phản ứng, sẽPCRỐng được chuyển đổi trực tiếp hoặc bảo quản trên băng.-20°CCác đoạn ngắn hơn ví dụ:100bp-1kbchỉ cần15Một phút là đủ để chuyển đổi các đoạn dài hơn để kéo dài thời gian phản ứng.60phút.

3. 取5μlCác sản phẩm phản ứng được chuyển đổi theo hướng dẫn của tế bào trạng thái cảm nhận (nếu có ít transistor hơn, tất cả các sản phẩm có thể được chuyển đổi và tất cả các tấm phủ dịch chuyển đổi có thể được chuyển đổi).

Xác định nhân bản dương tính:

Các thuộc địa có thể được lựa chọn theo từng trường hợp cụ thểPCRGiám định, chiết xuất chất.31013-100) Tiến hành giám định enzyme nội thiết hạn chế hoặc xác định trình tự.

Một bước Seamless Cloning Kit