Chất trắng: 5 ELISA KIT

Chất trắng: 5 ELISA KIT

Chất trắng: 5 ELISA KITLà công cụ quan trọng trong nghiên cứu khoa học dùng để kiểm tra định lượng hàm lượng interleukin - 5 trong các mẫu sinh học, cung cấp hỗ trợ mạnh mẽ cho việc nghiên cứu sâu hơn về phản ứng miễn dịch, cơ chế viêm.

1. Nguyên tắc phát hiện: Áp dụng phương pháp xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzym hai kháng thể. Các tấm enzyme của bộ dụng cụ được bọc trước bằng các kháng thể đặc hiệu chống lại IL-5. Khi mẫu được thêm vào, IL-5 trong mẫu liên kết cụ thể với kháng thể pha rắn. Các kháng thể kháng IL-5 được đánh dấu bởi enzyme sau đó được thêm vào để tạo thành phức hợp "kháng thể pha rắn - IL-5 - kháng thể enzyme". Các chất không liên kết được loại bỏ bằng cách rửa, dung dịch cơ chất (ví dụ: TMB) được thêm vào, dưới xúc tác enzyme, phản ứng tạo màu xảy ra với chất nền, với độ đậm màu tỷ lệ thuận với hàm lượng IL-5 trong mẫu. Nồng độ IL-5 trong mẫu được tính toán bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 450nm bằng máy đo enzyme tương phản với đường cong tiêu chuẩn.

2. Thành phần Kit

• Enzyme liên kết tấmCó 96 hoặc 48 lỗ được bọc trước kháng thể IL-5 và là chất mang phản ứng.

• Sản phẩm tiêu chuẩnThông thường là sản phẩm đông khô, thường có 2 chai. Trước khi sử dụng cần pha loãng dung dịch tiêu chuẩn và pha loãng thành các gradient nồng độ khác nhau như 0, 7,8, 15,6, 31,2, 62,5, 125, 250, 500 pg/mL để vẽ đường cong tiêu chuẩn.

• Mẫu xi giải phóng: Được sử dụng để pha loãng các mẫu được thử nghiệm với nồng độ quá cao, đảm bảo nồng độ mẫu nằm trong phạm vi phát hiện của bộ dụng cụ.

• Kháng thể Enzyme: Đó là kháng thể kháng IL-5 được đánh dấu bằng HRP, là chất cô đặc, khi sử dụng cần pha loãng với kháng thể tiêu chuẩn enzyme theo yêu cầu.

• Dung dịch pha loãng kháng thể Enzyme: Đặc biệt dùng để pha loãng kháng thể enzyme.

• Giải pháp cơ sởVí dụ, chất nền TMB phản ứng với HRP trong kháng thể nhãn enzyme để tạo ra sự thay đổi màu sắc.

• Chất tẩy rửa: Đa số là chất cô đặc, khi sử dụng cần pha loãng theo tỷ lệ với nước cất hoặc nước khử ion để rửa các tấm liên kết enzyme, loại bỏ các chất không liên kết và giảm nhiễu nền.

• Chấm dứt chất lỏng: Nói chung là dung dịch axit mạnh (như axit sulfuric), được sử dụng để chấm dứt phản ứng tạo màu của chất nền, làm cho chất lỏng phản ứng ổn định màu sắc và dễ đọc.

• Niêm phong tấm phim: Bao gồm các tấm liên kết enzyme trong thời gian ủ ấm, ngăn ngừa sự bay hơi của chất lỏng và ô nhiễm bên ngoài.

• Hướng dẫn sử dụng: Chi tiết cách sử dụng bộ dụng cụ, cân nhắc, chỉ số hiệu suất, v.v.

3. Yêu cầu mẫu

• Huyết thanhSau khi thu thập máu, để ở nhiệt độ phòng 2 giờ hoặc 4 ℃ qua đêm, 1000 × g ly tâm trong 20 phút, lấy sạch dự phòng. Lấy máu nên sử dụng thiết bị dùng một lần không có nhiệt nguyên, không có nội độc tố.

• Huyết tương: Có thể sử dụng axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA), heparin và các chất chống đông khác. Trong vòng 30 phút sau khi lấy mẫu, 1000 × g ly tâm ở 2-8 ℃ trong 15 phút, lấy sạch.

• nuôi cấy tế bào sạch: Nuôi cấy tế bào sạch 1000 × g ly tâm trong 20 phút, sau khi loại bỏ các mảnh vỡ tế bào và tạp chất, lấy sạch để phát hiện.

• Mô san lấp mặt bằng: Rửa sạch các mô bằng bộ đệm phosphate được làm lạnh trước (PBS, 0,01M, pH=7,4) để loại bỏ máu còn sót lại. Sau khi cắt mô, nhấn 1: 9 (w/v) để thêm PBS và nghiền kỹ trên băng. Sau 5 - 10 phút ly tâm 5000 x g, lấy sạch để phát hiện.

• Sau khi lấy mẫu, nếu kiểm tra trong thời gian ngắn, nó có thể được lưu trữ ở 4 ℃; Nếu cần bảo quản trong thời gian dài, cần đặt ở -20 ℃ hoặc -80 ℃, và để tránh đông lạnh nhiều lần, các mẫu tan máu thường không thích hợp để phát hiện.

4. Quy trình hoạt động

• Chuẩn bị: Lấy hộp thuốc thử từ tủ lạnh ra, cân bằng nhiệt độ phòng trước 30 phút. Đồng thời, dung dịch giặt cô đặc được pha loãng với nước cất hoặc nước khử ion theo tỷ lệ yêu cầu.

• Thêm mẫu: Đặt các lỗ trống, các lỗ tiêu chuẩn và các lỗ mẫu. Lỗ trống được thêm vào mẫu xi giải phóng, lỗ tiêu chuẩn được thêm vào nồng độ khác nhau của các sản phẩm tiêu chuẩn, lỗ mẫu được thêm vào mẫu được xử lý, số lượng mẫu mỗi lỗ thường là 100 μL, trộn đều nhẹ nhàng, 37 ℃ ấm lên trong 90 phút.

• giặt rửa: Sau khi ôn dục kết thúc, bỏ đi chất lỏng trong lỗ, dùng chất tẩy rửa đổ đầy các lỗ, ngâm 1 - 2 phút rồi quăng khô, lặp lại giặt 5 lần, đảm bảo đáy rửa sạch chất chưa kết hợp.

• Kháng thể với enzyme: Mỗi lỗ cho thêm 100 ml dung dịch kháng thể được pha loãng tốt, 37 độ C ôn dục 60 phút.

• Rửa lại: Lặp lại các bước giặt trên.

• Kết xuất màuMỗi lỗ thêm dung dịch cơ bản 90 μL, trộn đều nhẹ nhàng, 37 ℃ tránh ánh sáng hiển thị màu 15-30 phút (cần được đánh giá theo tình hình hiển thị màu thực tế).

• Chấm dứt phản ứng: Mỗi lỗ được thêm vào 50 μL terminator, khi màu sắc của dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng.

• Đọc: Độ hấp thụ (giá trị OD) của mỗi lỗ được đo bằng máy đo enzyme ở bước sóng 450nm trong vòng 15 phút sau khi chấm dứt dịch.

• Kết quả tính toán: Lấy nồng độ sản phẩm tiêu chuẩn làm tọa độ ngang, giá trị OD làm tọa độ dọc, vẽ đường cong tiêu chuẩn. Theo giá trị OD của mẫu để tìm nồng độ tương ứng từ đường cong tiêu chuẩn, nếu mẫu được pha loãng, cần nhân với bội số pha loãng tương ứng để có được nồng độ thực tế.