Thử nghiệm với yếu tố apoptosis Caspase-389

Thử nghiệm với yếu tố apoptosis Caspase-389

Caspase3

CaspaseLà một họ protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis. Caspase3, còn được gọi là CPP32, là một enzyme quan trọng trong quá trình apoptosis của tế bào, có thể cắt procaspase 2.6.7 và 9 và có thể cắt trực tiếp nhiều chất nền caspase, bao gồm: PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin Và fodrin, v.v. Những vết cắt protein qua trung gian caspase 3 này là một phần quan trọng của cơ chế phân tử apoptosis của tế bào. Caspase 3 cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis nhân, bao gồm cả chromatin rắn

Co lại, đoạn ngắn DNA, v. v. Caspase 3 cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo bọt tế bào (cell blebbing).

Nguyên tắc phát hiện dựa trên casepase 3 có thể xúc tác chất nền AC-DEVD-pNA để tạo ra pNA màu vàng (-itroaniline), do đó hoạt động của casepase 3 có thể được phát hiện bằng cách xác định độ hấp thụ. PNA có sự hấp thụ mạnh gần 405nm. Các đường cong tiêu chuẩn được thực hiện với pNA của sản phẩm màu vàng có thể được sử dụng làm sản phẩm tiêu chuẩn cho hoạt động enzyme caspase 3 định lượng.

Caspase-8

Caspase 8, thường tồn tại dưới dạng enzyme, được kích hoạt trong quá trình truyền tín hiệu apoptosis của tế bào, được coi là caspase ngược dòng trong quá trình truyền tín hiệu apoptosis của tế bào, được kích hoạt trong quá trình apoptosis trung gian Fas-receptor và TNFR-1, tạo thành một dimer bao gồm p18 và p10, kích hoạt thêm caspase 4, caspase 6 ở hạ lưu. caspase 9 hoặc caspase 10 Phương pháp này dựa trên thực tế là Caspase 8 có thể xúc tác chất nền AC-IETD-pNA để tạo ra pNA màu vàng (-nitraniline), do đó hoạt động của Caspase 8 có thể được phát hiện bằng cách xác định độ hấp thụ. PNA có sự hấp thụ mạnh gần 405nm. Giá trị OD405nm của mẫu thử nghiệm tham chiếu đến đường cong tiêu chuẩn được thực hiện bởi pNA và hoạt động enzyme Caspase 8 của mẫu có thể được tính toán.

Caspase-9

Caspase 9, còn được gọi là ICE-LAP6 hoặc Mch6, là một tế bào.NameCaspase ngược dòng trong quá trình truyền tín hiệu. Sau khi ty thể giải phóng cytochrome c, caspase 9 có thể hình thành phức hợp với cytochrome c và Apaf1, đồng thời được kích hoạt. Kích hoạt caspase 9 có thể kích hoạt caspase 3, enzyme chính của apoptosis, do đó thúc đẩy tín hiệu apoptosis tiếp theo. Kích hoạt Caspase 9 có thể được điều chỉnh bằng phosphoryl hóa.

Phương pháp này dựa trên việc Caspase 9 có thể xúc tác chất nền Ac-LEHD-pNA để tạo ra "pNA màu vàng nguyên chất (p-nitroaniline), do đó có thể được phát hiện bằng cách xác định độ hấp thụ.

Hoạt động của Caspase 9 PNA có sự hấp thụ mạnh gần 405nm. Giá trị OD405nm của mẫu thử nghiệm tham chiếu đến đường cong tiêu chuẩn được tạo ra bởi pNA và hoạt động enzyme Caspase 9 của mẫu có thể được tính toán.

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

yếu tố chết caspase3/8/9 Kiểm tra mẫu chuẩn bị:

1) Mẫu tế bào: lấy 1x107 tế bào (khoảng 1 T25 khối lượng tế bào chai nuôi cấy), 600g ly tâm 4 ° C trong 5 phút để thu thập tế bào, cẩn thận hút sạch, rửa PBS một lần. Sau khi hấp thụ thanh lọc, mỗi mẫu tế bào ống thêm vào dịch nhiệt phân 100U, dung dịch nhiệt phân 15 phút. 4 ° C 16,000g ly tâm trong 10-15 phút, chuyển chất tẩy rửa vào ống ly tâm được làm lạnh trước khi tắm nước đá. Xác định ngay hoạt động enzyme của caspase 3 hoặc -70 ° C để bảo quản mẫu. Bạn cũng có thể lấy một lượng nhỏ mẫu để xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford, cố gắng đạt 1-3 mg/ml.

2) Mẫu mô: khoảng 10 mg mô được thêm vào chất lỏng nứt 100ul, san lấp mặt bằng thủy tinh san lấp mặt bằng trên bồn tắm đá. Sau đó, bùn đồng đều được chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và bồn nước đá bị nứt thêm 5 phút nữa. 4 ° C 16,000g ly tâm trong 10-15 phút, chuyển chất tẩy rửa vào ống ly tâm được làm lạnh trước khi tắm nước đá. Xác định ngay hoạt động enzyme của caspase 3 hoặc bảo quản -70 ° C

Mẫu. Bạn cũng có thể lấy một lượng nhỏ mẫu để xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford, cố gắng đạt 1-3 mg/ml.

Đường cong tiêu chuẩn phát hiện hoạt động Caspase-3

Chu kỳ thí nghiệm: Hoàn thành trong vòng 7 - 10 ngày làm việc, lặp lại ưu đãi kiểm tra.

Ghi chú của khách hàng

1. Kháng thể: Tư vấn trướcThượng Hải nghiên cứu cẩn thậnSinh học, xác định rõ chủng kháng thể và có kháng thể này để sử dụng hay không. Nếu không thể thương lượng giữa hai bên, khách hàng tự mua cung cấp hoặc công ty chúng tôi mua hộ;

2. Thu thập và bảo quản mẫu vật:

① Mẫu mô: mô tươi được đưa vào nitơ lỏng hoặc 70 độ để bảo quản, mô không ít hơn 100 mg (khoảng kích thước của đậu xanh);

② Nuôi cấy tế bào: Lấy không ít hơn 000000 tế bào vào ống EP thông qua số lượng tế bào, thêm 0,5ml nước muối sinh lý hoặc chất bảo vệ protein, sau khi trộn đều bảo quản trong tủ lạnh (-70 ° C, tránh đông lạnh nhiều lần);

③ Mẫu tế bào máu: Bảo quản mẫu máu bằng ống chống đông hoặc phân lập tế bào bằng dịch bạch huyết sau khi thêm 0,5ml nước muối sinh lý hoặc chất bảo vệ protein, bảo quản (-70 ° C có thể bảo quản lâu dài, tránh đông lạnh lặp đi lặp lại)

④ Huyết thanh hoặc tế bào nuôi cấy mẫu vật: Ly tâm loại bỏ tạp chất sau đó lấy làm sạch vào ống EP, bảo quản (trên 4 ° C có thể bảo quản 15-20 ngày, -70 ° C có thể bảo quản lâu dài, tránh đông lạnh lặp đi lặp lại)

3, vận chuyển mẫu: tùy chọn bất kỳ cách nào sau đây để gửi mẫu

a) Mẫu mô, mẫu tế bào được vận chuyển bằng đá khô hoặc sau khi thêm chất bảo vệ protein vào túi đá;

② Mẫu tế bào cũng có thể được gửi trực tiếp đến chai nuôi cấy (niêm phong đảm bảo không gây ô nhiễm, chất lỏng nuôi cấy không rò rỉ, tế bào không phát triển quá đầy đủ, khoảng 50%, đổ đầy chất lỏng nuôi cấy);

Huyết thanh hoặc dịch thượng thanh trực tiếp thêm túi chườm đá (niêm phong đảm bảo chất lỏng không rò rỉ, tùy thuộc vào đường xá gần 2 - 3 ngày có thể đến).

Dịch vụ thay thế thí nghiệm: