Mã hàng：B1013/4/5/6

Điều kiện lưu trữ：-20 ℃ lưu trữ, thành phần A cần tránh ánh sáng, tránh đóng băng và tan chảy lặp đi lặp lại.

Thành phần sản phẩm：

Giới thiệu sản phẩm

Một đặc điểm nổi bật của apoptosis tế bào là nhiễm sắc thể tế bào.Sự xuống cấp của DNA, sự xuống cấp này rất cụ thể và đều đặn, tạo ra các đoạn DNA có độ dài khác nhau gấp nhiều lần số nguyên 180 bp-200 bp, thể hiện dưới dạng biểu đồ Ladder thang cụ thể trong điện di gel agarose. Bộ dụng cụ này sử dụng phương pháp TUNEL để xúc tác sự pha trộn xúc tác đầu cuối 3′-OH của DNA bị phá vỡ trong các tế bào apoptosis bằng cách áp dụng Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) trong quá trình chuyển DNA cuối cùng. ®/ Cy-dUTP，YF ®/ DNA được đánh dấu Cy-dUTP có thể được quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang hoặc định lượng bằng máy đo tế bào dòng chảy. Phương pháp TUNEL có thể chọn lọc phát hiện các tế bào apoptosis, thay vì các tế bào hoại tử hoặc các tế bào bị phá vỡ chuỗi DNA do chiếu xạ và điều trị bằng thuốc. dUTP được đánh dấu (ví dụ:ĐấtCao TândUTP,sốngVũ Tố-dUTP）， Phát hiện tại chỗ có thể được thực hiện trực tiếp và là một phương tiện phát hiện nhanh hơn và trực tiếp hơn.

Bộ dụng cụ này có nhiều ứng dụng và có thể được sử dụng để phát hiện apoptosis tế bào trong các lát đông lạnh hoặc parafin, cũng như các tế bào dán tường nuôi cấy hoặc các tế bào lơ lửng. Phát hiện có chọn lọc các tế bào apoptosis thay vì các tế bào hoại tử hoặc do chiếu xạ và điều trị bằng thuốcCác tế bào có chuỗi DNA bị phá vỡ. Bộ dụng cụ này phát hiện apoptosis tế bào, mất thời gian ngắn, chỉ với một bước nhuộm phản ứng, nó có thể được phát hiện sau khi rửa.

Cách sử dụng

Vật liệu thí nghiệm (tự chuẩn bị)

Bộ đệm PBS (pH~7,4)

0,4% Triton X-100 (công thức PBS)

0,1% Triton X-100 (PBS với 5 mg/mLBSA)

4%nhiềuJu 甲quan（Hệ Trung cấp (

Bút miễn dịch

Dung môi bị mất sáp (mẫu lát parafin)

Paraffin Wax Slice Xử lý thuốc thử liên quan

Chống huỳnh quang dập tắt máy tính bảng

dH2O

Thiết kế thử nghiệm

A. Đối chứng dương tính

DNaseI xử lý để chuẩn bị slide kiểm soát dương tính. DNase I có thể tiêu hóa một hoặc hai sợi DNA tiếp xúc với các đầu 3'-OH, gây ra apoptosis nhân tạo. Mỗi lần thí nghiệm làm một lần là được. (Dùng để kiểm tra thử nghiệm và bộ dụng cụ thử nghiệm có vấn đề gì không)

B. Đối chứng tiêu cực

Sử dụng không chứaTunel Reaction Buffer cho TdT Enzyme, thay thế TdT Enzyme bằng ddH2O. (Chủ yếu là nhuộm không đặc hiệu để loại trừ các nguyên nhân như apoptosis của chính tế bào, quá trình hoạt động, và điều chỉnh cường độ phơi sáng chụp.)

C. Nhóm xử lý thí nghiệm

Tổ thí nghiệm hoạt động bình thường theo hướng dẫn.

D. Nhóm kiểm soát thực nghiệm

Tổ thí nghiệm hoạt động bình thường theo hướng dẫn.

Các bước thử nghiệm

1, Chuẩn bị mẫu:

（1) Đối với các tế bào dán tường hoặc phết tế bào

PBS làm sạch 1 lần.

Lưu ý: Nếu bạn lo lắng rằng các tế bào có vết bẩn tế bào không phù hợp, mẫu có thể được làm khô để làm cho các tế bào phù hợp hơn.

b. Cố định: Thêm vào lượng vừa phải 4%nhiềuJu 甲quan（PBS xây dựng), 4 ℃ cố định 30 phút. PBS rửa 2 lần.

Độ trong suốt: Thêm 0,4% TritonX-100 (PBS) ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. PBS rửa 2 lần.

Bước 2: Phản ứng Tunel

（2) Đối với các tế bào treo hoặc đình chỉ tế bào

a. Thu thập tế bào (3-5 × 10)⁶tế bào),1000rpm ly tâm 5 phút, PBS rửa 2 lần.

b. Cố định: Thêm vào lượng vừa phải 4%nhiềuJu 甲quan（PBS xây dựng) treo lại đầy đủ các tế bào, cố định ở 4 ℃ trong 30 phút. 2000 vòng/phút ly tâm 5 phút, PBS rửa 2 lần.

Độ trong suốt: Thêm 0,4% TritonX-100 (PBS) ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. 2000 vòng/phút ly tâm 5 phút, PBS rửa 2 lần.

Bước 2: Phản ứng Tunel

（3) Cắt mô parafin

a. Đặt lát sáp parafin trên giá cắt lát, đặt lát nướng 60 phút trong lò nướng 60 ℃.

b. Mất sáp và hydrat hóa: lần lượt đặt các mẫu thái lát vào xylene I (10 phút) xylene II (10 phút) 100% ethanol I (5 phút) 100% ethanol II (5 phút) 95% ethanol (5 phút) 90% ethanol (5 phút) 80% ethanol (5 phút) 70% ethanol (5 phút) ddH2O rửa sạch 5 phút, rửa sạch 2 lần.

Lưu ý: Xylene là độc hại và dễ bay hơi, vui lòng làm điều này trong tủ hút.

c. Dùng giấy lọc hút khô chất lỏng xung quanh mẫu cắt lát, dùng bút miễn dịch hóa vòng quanh đường viền mẫu, để hạ lưu thông suốt và đánh dấu.

Ghi chú: Nếu các thao tác thí nghiệm tiếp theo phát hiện các đường viền của bút miễn dịch bị phá vỡ, cần phải kịp thời vẽ lại.

d. Độ trong suốt: dung dịch Proteinase K 2 mg/mL được pha loãng với PBS ở nồng độ cuối cùng là 40 µg/mL theo tỷ lệ 1: 50, với 100 µL nhỏ giọt trên mỗi mẫu để dung dịch bao phủ toàn bộ khu vực mẫu, ủ ở 37 ° C trong 30 phút.

Ghi chú:Proteinase K thấm qua màng tế bào và màng nhân, do đó cho phép các tác nhân nhuộm từ các bước tiếp theo xâm nhập đầy đủ vào nhân để phản ứng, cải thiện hiệu quả đánh dấu. Thời gian ủ quá lâu có thể làm tăng nguy cơ các lát mô rơi ra khỏi tấm sóng mang trong các bước giặt tiếp theo, quá ngắn có thể gây ra xử lý thẩm thấu không đầy đủ, ảnh hưởng đến hiệu quả đánh dấu. Để có kết quả tốt hơn, nồng độ Proteinase K, thời gian ủ và nhiệt độ cần được tối ưu hóa cho các loại mẫu mô khác nhau.

e. Nhúng mẫu cắt lát vào 1 × PBS rửa ba lần, mỗi lần 5 phút, hút chất lỏng dư thừa bằng giấy lọc, đặt mẫu đã xử lý trong hộp ướt để giữ ẩm.

Lưu ý: Bước này phảiProteinase K được rửa sạch, nếu không sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến phản ứng đánh dấu tiếp theo.

Bước 2: Phản ứng Tunel

（4) Cắt mô đông lạnh

a. Cố định: Lấy miếng đông lạnh ra và trở lại nhiệt độ phòng. Nhúng mẫu lát vào 4%nhiềuJu 甲quan（PBS) ở nhiệt độ phòng cố định 30 phút. Nhúng mẫu lát vào 1 × PBS rửa ba lần, mỗi lần 10 phút.

Ghi chú: Nếu lo lắng tẩy rửa không sạch sẽ, ảnh hưởng đến hiệu quả nhuộm màu cuối cùng. Có thể thêm một lượng vừa phải sau khi sửa chữa formaldehyde hoàn thành2 mg / mlCamAn axitrửa sạch10min， Trung hòa chất lỏng cố định còn sót lại, sau đó tiến hành rửa PBS.

b. Dùng giấy lọc hút khô chất lỏng xung quanh mẫu cắt lát, dùng bút miễn dịch hóa vòng quanh đường viền mẫu, để hạ lưu thông suốt và đánh dấu.

Ghi chú: Nếu các thao tác thí nghiệm tiếp theo phát hiện các đường viền của bút miễn dịch bị phá vỡ, cần phải kịp thời vẽ lại.

c. Độ trong suốt: dung dịch Proteinase K 2 mg/mL được pha loãng với PBS ở nồng độ cuối cùng là 40 µg/mL theo tỷ lệ 1: 50, với 100 µL nhỏ giọt trên mỗi mẫu để dung dịch bao phủ toàn bộ khu vực mẫu và ủ ở 37 ° C trong 20 phút.

Ghi chú:Proteinase K thấm qua màng tế bào và màng nhân, do đó cho phép các bước tiếp theo của thuốc thử nhuộmNhập đầy đủ vào nhân tế bào để phản ứng và tăng hiệu quả đánh dấu. Thời gian ủ quá lâu có thể làm tăng nguy cơ các lát mô rơi ra khỏi tấm sóng mang trong các bước giặt tiếp theo, quá ngắn có thể gây ra xử lý thẩm thấu không đầy đủ, ảnh hưởng đến hiệu quả đánh dấu. Để đạt được kết quả tốt hơn,Nồng độ Proteinase K, thời gian ủ và nhiệt độ cần được tối ưu hóa cho các mẫu mô khác nhau. Nếu tối ưu hóa nồng độ Proteinase K và thời gian ủ vẫn không cải thiện hiệu quả nhuộm, bạn có thể chọn ngâm mẫu 1% Triton X-100 (PBS) với sự thấm nước ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút; Sau đó, các mẫu cắt lát được ngâm trong 1 × PBS rửa ba lần, mỗi lần 5 phút.

d. Ngâm mẫu cắt lát trong 1 × PBS rửa ba lần, mỗi lần 5 phút, hút chất lỏng dư thừa bằng giấy lọc, đặt mẫu đã xử lý trong hộp ướt để giữ ẩm.

Lưu ý: Bước này phảiProteinaseK được rửa sạch, nếu không sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến phản ứng đánh dấu tiếp theo.

Bước 2: Phản ứng Tunel

（5) Xử lý dương tính (chỉ kiểm soát dương tính thực hiện bước này, các mẫu khác thực hiện bước phản ứng TUNEL trực tiếp)

Dùng ddH2O pha loãng 10×DNase I Buffer thành 1×DNase I Buffer theo tỷ lệ 1:10.

b. Thêm 100 µL 1 × DNase I Buffer vào mẫu đã xử lý, bao gồm toàn bộ khu vực mẫu, cân bằng nhiệt độ phòng 5 phút.

c. Pha loãng DNase I (2 U/μL) với 1 × DNase I Buffer ở nồng độ 1: 100 đến 20 U/mL dung dịch làm việc.

Bỏ Buffer, thêm dung dịch DNaseI nồng độ 100μL 20U/mL, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.

Loại bỏ chất lỏng làm việc DNase I, làm sạch PBS 2 lần.

Bước 2: Phản ứng Tunel

2) Phản ứng Tunel

（B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

（2) Đối với các tế bào dán tường, phết tế bào hoặc cắt mô

a. Mỗi mẫu được thêm vào 50 μL chất lỏng phản ứng TUNEL để chất lỏng phản ứng bao phủ mẫu đồng đều. 37 ℃ Thời gian thích hợp để ủ tránh ánh sáng (15-30 phút cho tế bào, 1 giờ cho mô).

Ghi chú:Chất lỏng phản ứng TUNEL 50 μL phù hợp với các tấm phết, lát hoặc 96 lỗ (các tấm lỗ khác nhau có thể điều chỉnh thể tích chất lỏng phản ứng TUNEL một cách thích hợp, bao gồm các tế bào là ok). Nếu mẫu được thử nghiệm là vết bẩn, lát hoặc trong tấm 24 lỗ, tấm 12 lỗ hoặc tấm 6 lỗ, bạn có thể sử dụng màng chống hơi hoặc tự cắt thành tấm nhựa tròn nhỏ hơn một chút bằng túi tự niêm phong hoặc vật liệu thích hợp khác, sau khi nhỏ giọt chất lỏng phản ứng TUNEL phủ lên mẫu, bạn có thể ngăn chặn sự bay hơi của chất lỏng phản ứng TUNEL và làm cho chất lỏng phản ứng TUNEL phủ đều mẫu.

Loại bỏ chất lỏng phản ứng TUNEL, sau khi làm sạch PBS 2 lần, làm sạch Triton X-100 0,1% (PBS, bao gồm 5mg/mLBSA) 3 lần trong 5 phút để các dấu hiệu không phản ứng tự do có thể được loại bỏ sạch hơn.

c. (Tùy chọn) Mỗi mẫu thêm thuốc nhuộm DAPI với nồng độ thích hợp là 5 μg/mL, tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòngấp trứng5min。 Sau khi nhuộm xong, bỏ thuốc nhuộm DAPI và rửa PBS 2 lần, mỗi lần 5 phút.

d. (Tùy chọn) Slice Niêm phong: Mỗi giọt mẫu cộng với 20 μL Anti-fluorescent dập tắt máy tính bảng (Anti-fluorescent)Máy tính bảng dập tắt có thể không phù hợp với một số loại thuốc nhuộm, nên thử nghiệm trước khi thử nghiệm để kiểm tra độ phù hợp), đậy nắp, nhẹ nhàng chạm vào nắp bằng đầu cùn của nhíp, loại bỏ bong bóng để làm cho niêm phong

Wan đầy đủ.

e. Hút chất lỏng dư thừa bằng giấy lọc, thêm 100 μL PBS vào khu vực mẫu để giữ cho mẫu ẩm,Xem ngay dưới kính hiển vi huỳnh quang.

（3) Đối với các tế bào treo hoặc đình chỉ tế bào

a. Mỗi ống mẫu thêm dung dịch phản ứng 50μ LTUNEL nhẹ nhàng treo lại tế bào, ủ tránh ánh sáng 37oC15-30min。 Nhẹ nhàng treo lại các tế bào với một pipet dấu vết mỗi 10 phút.

2.000 vòng/phút ly tâm 5 phút, loại bỏ chất lỏng phản ứng TUNEL với 0,1% Triton X-100（PBS được xây dựng với 5 mg/mL BSA) rửa 2 lần trong 5 phút để các dấu hiệu không phản ứng tự do có thể được loại bỏ sạch sẽ hơn.

c. Mỗi ống mẫu cho thêm dung dịch nhuộm DAPI có nồng độ 100 μL là 5 μg/mL, ủ trong 5 phút tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng.

D. Thêm 400 μL PBS treo lại tế bào, ngay lập tức phát hiện hoặc bôi nhọ bằng máy đo tế bào dòng chảyNhìn dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Lưu ý

1. Vui lòng ly tâm sản phẩm ngay lập tức đến đáy ống trước khi sử dụng, sau đó tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

2. Thời gian nhuộm có thể được giảm thích hợp khi nền nhuộm nặng hơn hoặc khi màu không đặc hiệu rõ ràng.

3. Đề nghị tăng nhóm đối chứng âm tính và nhóm đối chứng dương tính khi thí nghiệm.

4. Vui lòng đeo khẩu trang, găng tay khi sử dụng thành phần A, chẳng hạn như tiếp xúc với da, rửa sạch ngay lập tức với nhiều nước.

5. Tất cả các chất nhuộm huỳnh quang đều có vấn đề dập tắt, hãy cố gắng chú ý tránh ánh sáng để làm chậm quá trình dập tắt huỳnh quang.

6. Sản phẩm này chỉ giới hạn trong nghiên cứu khoa học, không được sử dụng để chẩn đoán hoặc điều trị lâm sàng, không được sử dụng trong thực phẩm hoặc dược phẩm, không được lưu trữ trong nhà ở thông thường.

7. Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc quần áo thử nghiệm và vận hành bằng găng tay dùng một lần.