Bộ dụng cụ biểu hiện protein không tế bào - Phiên bản tăng cường liên kết disulfide - Bột đông khô

Mã hàng：P0243L

Điều kiện lưu trữ：-80℃，1nămhiệu quả

Vận chuyển đá khô. Sau khi mở nắp, các thành phần phản ứng biểu hiện protein không tế bào được đặt ở -80 ° C để lưu trữ. Để tránh đóng băng và tan chảy lặp đi lặp lại, theo liều lượng phản ứng, chất lỏng A và chất lỏng B có thể được đóng băng nhanh chóng bằng nitơ lỏng sau khi tách riêng và đặt ở -80 ° C để lưu trữ.

Thành phần sản phẩm

Hướng dẫn sản phẩm

Bộ dụng cụ tổng hợp protein không tế bào (Cell-Free Protein Synthesis Kit)Sản phẩm tổng hợp protein bên ngoài cơ thể dựa trên dịch phân giải tế bào vi khuẩn ruột già. Sản phẩm sử dụngChất hoạt tính như ribosome, nhân tố phiên dịch, enzyme trong dịch phân tế bào, đồng thời bổ sung năng lượng,nucleotide, axit amin, muối vô cơ, v.v., tái cấu trúc phiên mã in vitro- Hệ thống phiên dịch. DNA hoặcRNA hoạt động như một khuôn mẫu và biểu hiện protein. Biểu hiện protein không tế bào là một loại không phụ thuộc vào vi khuẩn sống,Có thể biểu hiện protein với số lượng lớn một cách nhanh chóng và linh hoạt, so với các hệ thống biểu hiện tái tổ hợp truyền thống.Nhiều lợi thế:

1. biểu hiện protein nhanh, 1~2 giờ có thể biểu hiện mục đích protein, 8~24 giờ có thể đạt được tối đaRất nhiều.

2. Lượng protein biểu hiện cao, cao nhất có thể đạt protein trên 3 mg/ml.

3. phản ứng đơn giản và linh hoạt, chỉ cần thêm mẫu DNA hoặc RNA vào hệ thống phản ứng, có thểSử dụng96 lỗ hoặc ống ly tâm để phản ứng.

Lưu ý: Sản phẩm này có thể biểu hiện protein thông thường, thích hợp hơn để biểu hiện protein có liên kết disulfide.

Phạm vi áp dụng

Sản phẩm Jin được giới hạn cho mục đích nghiên cứu khoa học của các chuyên gia, không được sử dụng trong chẩn đoán hoặc điều trị lâm sàng, không được sử dụng trong thực phẩm hoặc dược phẩm.

Hướng dẫn vận hành

1. Xây dựng gen

Việc xây dựng các gen mục đích là rất quan trọng đối với biểu hiện protein và cách xây dựng hình ảnh dưới đây được khuyến khích. Gen đích có thể được xây dựng trên plasmid dương tính đi kèm với bộ dụng cụ này (xem hồ sơ plasmid bên ngoài để quét các tệp mã QR bên trong nhãn bao bì bên ngoài để biết chi tiết), tức là cách nó được xây dựng như sau; Cũng tương thích với pET9a, pET-23a và các plasmid dòng PET khác có chứa trình khởi động T7 nhưng không chứa operon lactose (lac).

Lưu ý: Các plasmid có chứa operon lactose (như pET28a, v.v.) sẽ có ảnh hưởng lớn đến sản lượng và không nên sử dụng trực tiếp.

Sơ đồ trình tự DNA của plasmid dương tính như sau:：

2. Chuẩn bị mẫu

Bộ dụng cụ tổng hợp protein không tế bào có thể sử dụng DNA hoặc mRNA làm khuôn để biểu hiện protein tái tổ hợp. Mẫu DNA được sử dụng có thể là plasmid, sản phẩm PCR hoặc khuếch đại vòng RCA bằng phi29.

2.1 Hạt: thu được plasmid thích hợp cho các phản ứng không có tế bào thông qua tổng hợp công ty di truyền, hoặc subclonal và chiết xuất plasmid bằng phương pháp thanh lọc cột;

2.2 Sản phẩm PCR: Thiết kế mồi, mồi chuyển tiếp khoảng 200 bp ở thượng nguồn của trình khởi chạy T7, mồi đảo ngược khoảng 200 bp ở hạ nguồn của trình khởi chạy kết thúc (bao gồm thiết bị đầu cuối T7), khuếch đại khuôn mẫu, đoạn DNA tuyến tính thu được có thể được đưa trực tiếp vào hệ thống phản ứng không tế bào mà không cần thanh lọc. Các base 200 bp ở thượng lưu và hạ lưu hoạt động để bảo vệ các đoạn DNA tuyến tính khỏi bị phân hủy bởi các enzyme ngoại bào nội sinh.

2.3 Sản phẩm RCARCA được khuếch đại bằng cách sử dụng phi29 polymerase, hexamồi ngẫu nhiên và các sản phẩm DNA thu được có thể được sử dụng trực tiếp trong các hệ thống phản ứng không có tế bào.

2.4 PCR và RCA có thể được kết hợp với Golden Gate và Gibson Assembly để cải thiện đáng kể tốc độ và dòng chảy của các mẫu DNA.

2.5Cần định lượng chính xác mẫu DNA trước khi sử dụng; Nên sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất plasmid chất lượng cao để chiết xuất plasmid, tránh giới thiệu RNase A; Các plasmid được trả lại bởi các công ty tổng hợp gen cần nhấn mạnh việc sử dụng phương pháp thanh lọc cột, nếu không nó không thể được sử dụng trực tiếp cho các phản ứng không có tế bào.

3. Không biểu hiện protein tế bào

3.1Chất lỏng A và B cần thiết để tính toán dựa trên tổng lượng của hệ thống phản ứng (tỷ lệ thể tích 1: 2), tác nhân được sử dụng được thêm vào băng vào bình phản ứng (ví dụ: ống ly tâm đáy tròn 2 ml) và trộn đều. Toàn bộ quá trình hoạt động cần đeo găng tay, mặt nạ và sử dụng đầu hút pipet và bình phản ứng không có nguồn enzyme để tránh sự ra đời của enzyme nuclease.

Hệ thống phản ứng không tế bào có thể được pha trộn theo bảng dưới đây:

3.2Thêm DNA mẫu vào hệ thống phản ứng, nồng độ cuối cùng của mẫu DNA được khuyến nghị là 5~10 μg/ml, có thể tối ưu hóa lượng bổ sung mẫu DNA.

3.3Đặt bình phản ứng vào máy lắc thông thường hoặc máy trộn nhiệt độ không đổi để biểu hiện protein không tế bào, nhiệt độ phản ứng được đề nghị là 25~30 ℃. Giảm nhiệt độ làm giảm tốc độ tổng hợp protein, nhưng làm tăng độ hòa tan của protein. Nói chung, phản ứng khoảng 8 giờ có thể đạt được sản xuất protein tối đa, cũng có thể phản ứng qua đêm 16 giờ. Khi nhiệt độ phản ứng giảm, thời gian phản ứng nên được tăng lên một cách thích hợp.

3.4Sự biểu hiện của protein không tế bào đòi hỏi đủ oxy và khi sử dụng ống ly tâm đáy tròn 2 ml làm bình phản ứng, hệ thống phản ứng không vượt quá 100 μl. Phản ứng protein không tế bào có thể được khuếch đại theo tỷ lệ tương đương, hệ thống phản ứng khuếch đại cần sử dụng bình phản ứng lớn hơn, chẳng hạn như bình lắc, v.v., đồng thời đảm bảo tốc độ quay của máy lắc (200 vòng/phút).

4. Phát hiện

Kết thúc phản ứng, lấy chất lỏng phản ứng (kiểm tra toàn bộ protein) hoặc chất lỏng phản ứng (kiểm tra protein hòa tan) khoảng 1μl để biểu hiện protein mục đích của xét nghiệm điện di protein SDS-PAGE.

5. Kiểm soát tích cực

Bộ dụng cụ này có protein huỳnh quang màu xanh lá cây sf-GFP plasmid làm đối chứng dương tính và kết quả phản ứng có thể được quan sát trực tiếp bằng mắt thường. Sau khi biểu hiện thành công sf-GFP, hệ thống phản ứng không có tế bào sẽ có màu xanh lá cây rõ rệt.

Để định lượng chính xác sf-GFP, bạn có thể sử dụng máy đo enzyme (Ex/Em=485/528 nm).