Bộ thử nghiệm CHIP (Magnetic)

Mã hàng：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Điều kiện lưu trữ：4ºC tiết kiệm

Hướng dẫn sản phẩm

Bộ dụng cụ xét nghiệm CHIP được sử dụng để kết tủa các mảnh nhiễm sắc tố và liên kết với protein mục tiêu thông qua kết tủa miễn dịch và cuối cùng là bộ dụng cụ để phát hiện các mảnh nhiễm sắc tố kết tủa bằng các phương pháp như PCR hoặc Southern. Nó thường được sử dụng để kiểm tra xem một protein gắn kết DNA di truyền như một yếu tố phiên mã cụ thể hoặc histone có nằm trong cùng một phức hợp với trình tự DNA di truyền cụ thể dự kiến hay không. Kết luận về việc liệu protein mục tiêu trong cơ thể (In Vivo) và các đoạn DNA của bộ gen dự kiến có nằm trong cùng một phức hợp có thể thu được bằng xét nghiệm ChIP hay không. Kết quả xét nghiệm ChIP cho thấy sự liên kết này thực sự xảy ra trong tế bào.

bảnBộ dụng cụ kiểm tra ChIP sử dụng HA/DYKDDDK/Myc/GFP-Nanoab Magnetic Beads làm hạt cho CHIP Drop Down. Bộ dụng cụ kiểm tra ChIP được đặc trưng bởi lực liên kết mạnh mẽ và tiết kiệm thời gian và hiệu quả. Bộ dụng cụ cung cấp các mồi kiểm soát được trộn sẵn (Control Primers) có thể được sử dụng để khuếch đại một phần trình tự tương ứng của GAPDH con người, trình tự mồi là: 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Các bước hoạt động (chỉ để tham khảo):

I. Tối ưu hóa điều kiện xử lý siêu âm mẫu:

1. Chuẩn bị PBS làm mát trước vừa phải, cũng như PMSF 100mM. Tắm SDS Lysis Buffer đúng cách để SDS hòa tan hoàn toàn và trộn đều.

2. Nuôi cấy tế bào trong đĩa tế bào 250px với liều lượng 10 ml dung dịch nuôi cấy tế bào. Lượng formaldehyde vừa phải được thêm trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy tế bào tại thời điểm liên kết protein và DNA của bộ gen dự kiến sẽ xảy ra, nhẹ nhàng trộn đều, đến nồng độ cuối cùng là 1%. Sau đó ủ ở 37ºC trong 10 phút để liên kết chéo protein và DNA bộ gen tương ứng. Ví dụ: đĩa nuôi cấy tế bào 250px thêm 10ml dung dịch nuôi cấy tế bào cần thêm 270ul 37% formaldehyde. Xin lưu ý sử dụng formaldehyde trong thời hạn sử dụng chất lượng cao và hiệu quả nhất có thể. Các tế bào cũng có thể được nuôi cấy trong đĩa petri tế bào 150px, và lượng dung dịch liên quan cần được điều chỉnh theo tỷ lệ.

Thêm 1.1ml Glycine Solution (10X) và trộn đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

4. Đặt đĩa petri với các mẫu tế bào trên bồn tắm nước đá. Hút chất lỏng nuôi cấy có chứa formaldehyde và glycine, cố gắng giữ không có dư lượng chất lỏng.

5. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, trong thời gian đó pha loãng PMSF 100mM đến 1mM với PBS làm mát trước, tức là PBS chứa PMSF 1mM được xây dựng thành bồn tắm đá. Giải pháp nước PMSF phải được pha chế tươi, có thời gian bán hủy khoảng 30 phút trong pha nước.

Thêm 5-10ml PBS làm mát trước (với 1mM PMSF), rửa sạch tế bào, hút hết chất lỏng và cố gắng giữ không có dư lượng chất lỏng.

Thêm 5-10ml PBS làm mát trước (với 1mM PMSF) để rửa sạch tế bào, hút hết chất lỏng và cố gắng giữ không có dư lượng chất lỏng.

8. Thêm 1 ml PBS làm mát trước (với 1 mM PMSF) và cạo các tế bào bằng cách cạo tế bào và thu thập chúng vào ống ly tâm. Nếu tế bào có thể dùng súng thổi xuống, cũng có thể dùng súng thổi xuống. Các tế bào được đếm và lắp ráp thành khoảng 1 triệu tế bào mỗi ống.

9. 4ºC, 800-1000g ly tâm trong 1-2 phút, kết tủa đầy đủ các tế bào. Nếu lượng mưa không đủ, thời gian ly tâm có thể được kéo dài một cách thích hợp. Hút sạch, cố gắng giảm thiểu lưu lượng chất lỏng.

Chuẩn bị một lượng vừa phải SDS Lysis Buffer chứa 1mM PMSF. Kết tủa 1 triệu tế bào ở bước trên được treo lại với 0,2ml SDS Lysis Buffer chứa 1mM PMSF.

11. Ủ trên bồn nước đá trong 10 phút để phá vỡ hoàn toàn các tế bào.

Sonication để cắt DNA genome, làm cho phần lớn DNA bị phá vỡ thành 200-1000bp kích thước, nếu bạn có thể kiểm soát hầu hết các mảnh ở 400-800bp là tốt hơn. Trong quá trình siêu âm, hãy cẩn thận để giữ mẫu trong bồn tắm đá và giữ nhiệt độ thấp. Hiệu quả của cắt siêu âm có thể được phát hiện bằng điện di của gel agarose DNA thông thường sau khi khử liên kết chéo tiếp theo. Các điều kiện của sonication thường có thể được đặt thành 10 giây mỗi lần, tổng cộng 3-4 lần, 30% công suất tối đa khi công suất là 50W, sử dụng đầu siêu âm 2mm.

Thiết lập của các thiết bị xử lý siêu âm khác nhau không giống nhau, khi tìm kiếm các điều kiện siêu âm, bạn có thể cố định các điều kiện khác trước, trước tiên xác định thời gian mỗi lần siêu âm sẽ không dẫn đến sốt rõ rệt, sau đó lần mò số lần siêu âm khác nhau. Cho đến khi tìm được số lần siêu âm thích hợp hơn, hầu hết bộ gen có thể được tạo ra.DNA có kích thước 200-1000bp. Cần lưu ý rằng mỗi lần thể tích siêu âm và lượng tế bào nên được cố định, nếu không thì không thể sử dụng một điều kiện siêu âm tương đối cố định cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ghi chú: Sau khi siêu âm bộ genKhi thử nghiệm kích thước DNA, nếu sử dụng phương pháp nhuộm gel agarose (cách thuốc nhuộm axit nucleic được thêm vào bộ đệm tải) hoặc phương pháp nhuộm keo, vì SDS sẽ kết hợp với các loại thuốc nhuộm này trong điện di để tạo thành một dải bất thường, dải thường ở khoảng 500-1000bp, do đó sẽ có ảnh hưởng nhất định đến việc đánh giá kích thước DNA của bộ gen sau siêu âm. Đề nghị sử dụng phương pháp nhuộm sau để phát hiện kích thước dải, sử dụng phương pháp này sẽ không có dải bất thường xuất hiện, không ảnh hưởng đến việc đánh giá kích thước DNA của bộ gen sau siêu âm, và kích thước dải chính xác hơn.

13. Thêm 8ul 5M NaCl vào 0.2ml mẫu sonication, trộn đều. Nhiệt độ 65ºC trong 4 giờ để loại bỏ liên kết chéo giữa protein và DNA của bộ gen.

14. Cân bằng Tris với khối lượng bằng nhauNamefen，Vortex pha đều, sau đó ly tâm khoảng 4 độ C, 12.000 g trong 5 phút. Hấp thụ thanh lọc vào một ống ly tâm khác.

15. Thêm chloroform khối lượng bằng nhau, vortex pha trộn mạnh mẽ, sau đó 4ºC, 12000g khoảng 5 phút ly tâm. Hấp thụ thanh lọc vào một ống ly tâm khác.

Ghi chú：Việc chiết xuất phenolchloroform ở các bước 14 và 15 ở trên có thể được thực hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ làm sạch DNA.

16. Lấy một lượng nhỏ chất lỏng thu được thông qua chiết xuất phenol chloroform hoặc bộ dụng cụ làm sạch DNA, cho sản phẩm chiết xuất phenol chloroform có thể lấy 5-10ul, cho sản phẩm làm sạch bộ dụng cụ làm sạch DNA có thể lấy 2-5ul, tiến hành điện di gel agarose, quan sát hiệu quả cắt của sonication đối với DNA bộ gen.

Hai, nhiễm sắc chất miễn dịch lắng đọng:

1. Sau khi tối ưu hóa các điều kiện sonication mẫu, đối với các mẫu được kiểm tra theoTối ưu hóa điều kiện sonication mẫutrung1-11Các bước tiến hành thao tác và tham khảo các bước12 Tiến hành siêu âm.

2. Đối với các mẫu sonication ở 4ºC, 12000-14000g ly tâm 5 phút. Lấy sạch (khoảng 0,2ml) đến 2ml ống ly tâm và đặt trong bồn tắm đá.

Chuẩn bị một lượng vừa phải ChIP Dilution Buffer chứa 1mM PMSF. Thêm 1,8ml ChIP Dilution Buffer chứa 1mM PMSF để pha loãng mẫu sonication để có thể tích cuối cùng là 2ml.

4. Lấy mẫu 20ul làm Input để phát hiện tiếp theo. Lấy20ul HA / DYKDDDDK / Myc / GFP-Nanoab-từ hạtThêmPBS hoặc TBST dung dịch để 500ul để làm sạch thổi, đặt trên giá đỡ từ tính với pipet rửa sạch cẩn thận và làm sạch lặp lại 2-3 lần (để giảm không đặc hiệu 1 tốt hơn cũng có thể xử lý trước Beads với 1-5% BSA hoặc sữa tách béo trong 1 giờ).

5. làm sạch hoặc đóng cửa20ul HA / DYKDDDDK / Myc / GFP-Nanoab-từ hạtBước tham gia3 Trong số các mẫu còn lại, dung dịch của các mẫu không có tế bào có thể được sử dụng đồng thời làm đối chứng trống, cũng như các mẫu không có beads làm đối chứng âm tính hoặc các kháng thể không liên quan làm đối chứng âm tính. Trộn đều 30-60 phút bằng cách quay chậm hoặc lắc lư ở 4ºC để kết tủa protein đích hoặc phức hợp tương ứng.

6. Đặt các ống ly tâm trên có chứa mẫu trên giá đỡ từ tính trong 10 giây. Rất cẩn thận để loại bỏ sự rõ ràng trên và không bao giờ chạm vào lượng mưa. Sau đó, lượng mưa được rửa theo thứ tự với các dung dịch như sau, mỗi lần rửa với liều lượng 1 ml, mỗi lần rửa chậm hoặc xoay ở 4 ºC trong 3-5 phút, sau đó đặt trên giá từ tính trong 10 giây. Cẩn thận loại bỏ chất lỏng sạch và không bao giờ chạm vào lượng mưa.

Low Salt Immune Complex Wash Buffer Rửa 1 lần

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer rửa một lần.

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer được rửa một lần.

(d) TE Buffer rửa hai lần.

Ghi chú：Lượng mưa thu được sau khi hoàn thành tất cả các bước rửa ở trên có thể được sử dụng cho trình tự gen cho mục đích khuếch đại PCR hoặc trình tự gen cho mục đích phát hiện của Southern, hoặc cho xét nghiệm Western.

Ba,Trình tự gen PCR khuếch đại (chẳng hạn như trình tự gen mà sản phẩm ChIP được sử dụng cho mục đích phát hiện):

1.Fresh pha chế một lượng vừa phải Elution Buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3).

2. Hoàn thành các bướcCác bước kết tủa miễn dịch第7Sau bước, sau khi hoàn thành tất cả các bước giặt, thêm250ul Elution buffer。 Vortex trộn đều, xoay hoặc lắc ở nhiệt độ phòng tiếp tục rửa sạch trong 3-5 phút.

3. Đặt trên giá đỡ từ tính để tách trong 10 giây, chuyển Shangqing vào một ống ly tâm mới. Thêm 250ul Elution Buffer vào kết tủa. Vortex trộn đều, xoay hoặc lắc ở nhiệt độ phòng tiếp tục rửa sạch trong 3-5 phút.

4. Đặt trên giá từ tính tách ra 10 giây, lấy ra thanh lý. Và bước trước là hợp nhất thanh toán nhận được trong bước 3. Tổng cộng khoảng 500.

Thêm 20ul 5M NaCl vào 500ul và trộn đều. Nhiệt độ 65ºC trong 4 giờ để loại bỏ liên kết chéo giữa protein và DNA của bộ gen. Đối với mẫu 20ul thu được dưới dạng Input ở bước 2D, 1ul 5M NaCl được thêm vào, trộn đều và đun nóng 65ºC trong 4 giờ, cũng được sử dụng để loại bỏ liên kết chéo giữa protein và DNA của bộ gen. Sau khi hoàn thành bước này, bạn có thể tiếp tục với các bước tiếp theo hoặc đóng băng -20ºC trước và tiếp tục với các bước tiếp theo vào ngày hôm sau.

Ghi chú1Hiện tại, các mẫu có thể được sử dụngPCR， Có thể thử sử dụng mẫu 1, 2, 5 hoặc 10 ul làm mẫu cho các gen cho mục đích xét nghiệm PCR. Tại thời điểm này, ảnh hưởng của PCR và lượng DNA có thể bị kết tủa có liên quan đến việc liệu toàn bộ hệ thống khuếch đại PCR có dễ dàng khuếch đại gen hay không. Nếu thấy hiệu quả PCR không tốt, bạn có thể xem xét các bước tinh chế tiếp theo, tinh chế và cô đặc mẫu trước khi tiến hành kiểm tra PCR.

Ghi chú2: Thông thường, đề nghị tiến hành thanh lọc sau đó mới tiến hànhXét nghiệm PCR, Input thường không cần thực hiện các bước thanh lọc tiếp theo.

6. Thêm 10ul 0,5M EDTA vào khoảng 520ul mẫu, 20ul 1M Tris pH 6,5 và 1ul 20mg/ml protease K. Ủ 45ºC trong 60 phút sau khi trộn.

7. Thêm cân bằng khối lượng bằng TrisNamefen，Vortex pha đều, sau đó ly tâm khoảng 4 độ C, 12.000 g trong 5 phút. Hấp thụ thanh lọc vào một ống ly tâm khác.

8. Thêm chloroform khối lượng bằng nhau, vortex trộn đều, sau đó ly tâm khoảng 4 ºC, 12000g trong 5 phút. Hấp thụ thanh lọc vào một ống ly tâm khác.

Thêm 20ug glycogen hoặc yeast tRNA, thêm 1/10 thể tích NaAc 3M, pH5.2 và thêm 2,5 lần thể tích ethanol khan. Sau khi trộn đều -70ºC kết tủa không ít hơn 1 giờ, hoặc -20ºC kết tủa hơn 8 giờ.

10. 4ºC, 12000-14000g ly tâm trong 10 phút, cẩn thận hút hầu hết các thanh lọc, không bao giờ chạm vào kết tủa.

11. Thêm khoảng 1ml 70% lượng mưa ethanol. 4ºC, 12000-14000g ly tâm trong 10 phút, cẩn thận hút hầu hết các thanh lọc, không bao giờ chạm vào kết tủa.

12. 4ºC, 12000-14000g ly tâm 1 phút, cẩn thận hút chất lỏng dư.

13. Kết tủa DNA treo lại với một lượng nhỏ TE hoặc nước, được sử dụng để kiểm tra PCR của gen đích. Các mồi cho PCR có thể được thiết kế tốt nhất cho 2 nhóm, có thể sử dụng Input làm mẫu để tìm hiểu trước các điều kiện PCR tương ứng và chọn một nhóm mồi tốt hơn để phát hiện PCR cuối cùng. Trong một số trường hợp, khi dải PCR quá yếu, công nghệ PCR nested có thể được sử dụng với hai vòng khuếch đại.

Ghi chú: BướcCác bước từ 7 đến 13 cũng có thể được sử dụng để tinh chế DNA bằng bộ dụng cụ tinh chế DNA thích hợp.

Bốn,Western kiểm tra sản phẩm ChIP (nếu sản phẩm ChIP được sử dụng để kiểm tra Western):

1. Bước tiếp theoKết tủa miễn dịch nhiễm sắc tố第8 bước, sau khi hoàn thành tất cả các bước rửa, thêm 25ul SDS-PAGE protein trên giống đệm (1X). Dung dịch đệm trên giống protein SDS-PAGE (1X) có thể được tạo ra bằng cách pha loãng với nước với dung dịch đệm trên giống protein SDS-PAGE (5X). Tắm nước sôi đun sôi 10 phút.

2. Lấy 10-20ul để kiểm tra phương Tây.

Lưu ý:

1, cần phải tự chuẩn bị cho kháng ChIP, 37% formaldehyde, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Protease K, Glycogen hoặc tRNA, cân bằng TrisNamefenCloroform.95% ethanol, 70% ethanol, 3M NaAc (pH5.2) và khung từ, cạo tế bào hoặc xẻng tế bào.

2, cần tự chuẩn bị máy xử lý mẫu siêu âm (sonicator), còn được gọi là máy nghiền siêu âm hoặc máy nghiền tế bào siêu âm.

3, Khi sử dụng formaldehyde, vui lòng hoạt động trong tủ thông gió.

4, Sản phẩm này được giới hạn cho nghiên cứu khoa học của các chuyên gia, không được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng hoặc điều trị, không được sử dụng trong thực phẩm hoặc dược phẩm, không được lưu trữ trong nhà ở thông thường.

6, Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc quần áo thử nghiệm và vận hành găng tay dùng một lần.