Phát hiện chiều dài telomere

Phát hiện chiều dài telomere (telomere) là một cấu trúc đặc biệt ở đầu cuối DNA của bộ gen tuyến tính của sinh vật nhân chuẩn, là một phức hợp hình thành một đoạn trình tự DNA với protein, do đó không có sự hợp nhất giữa các đầu nhiễm sắc thể bình thường, đảm bảo tính toàn vẹn của mỗi nhiễm sắc thể, kiểm soát chu kỳ tăng trưởng và phân chia của tế bào, và liên quan chặt chẽ đến apoptosis, chuyển đổi tế bào và sinh hóa vĩnh cửu.

　　Phát hiện chiều dài telomere(telomere) là một cấu trúc đặc biệt ở cuối DNA của bộ gen tuyến tính của sinh vật nhân chuẩn, là một phức hợp của sự hình thành của một đoạn trình tự DNA với protein, do đó không có sự hợp nhất giữa các đầu nhiễm sắc thể bình thường, đảm bảo tính toàn vẹn của mỗi nhiễm sắc thể, kiểm soát chu kỳ tăng trưởng tế bào và phân chia, và liên quan chặt chẽ đến apoptosis tế bào, chuyển đổi tế bào và sinh hóa vĩnh cửu. DNA trình tự lặp lại telomere của con người bao gồm các TTAGGG được sắp xếp lặp đi lặp lại (xem hình bên phải).

Tế bào người bình thường trong quá trình phân chia, sự sao chép DNA không thể sao chép một đoạn ngắn của trình tự cuối cùng của nó, dẫn đến việc sau mỗi lần phân chia tế bào, DNA rút ngắn một chút, đây là "sự ẩn đầu cuối nhiễm sắc thể". Do sự bảo vệ của trình tự telomere ở cuối DNA, sự sao chép DNA chỉ mất một phần của trình tự telomere mà không gây nguy hiểm cho trình tự DNA bình thường. Khi các tế bào sao chép nhiều lần và telomere rút ngắn đến một mức độ nhất định, trình tự DNA bình thường trở nên không ổn định, và tại thời điểm này, các tế bào bắt đầu già đi và chết. Nghiên cứu cho thấy, trong điều kiện bình thường, tế bào người sau khi phân chia sao chép trung bình khoảng 50 lần sẽ bị hoại tử do tự sản xuất độc tố, đây được gọi là "giới hạn Haeflick".

Bộ dụng cụ sản phẩm này sử dụng qPCR huỳnh quang hai màu (SYRBgreen+VIC) để phát hiện chiều dài tương đối của telomere và đối tượng thử nghiệm là máu, gạc miệng hoặc DNA tế bào. Bộ dụng cụ này có các tính năng sau.

1. Ổn định: hoạt động ống kín trong suốt quá trình, không gây ô nhiễm chéo.

2. Đáng tin cậy: phát hiện ống đơn telomere và nhân tố bên trong, giảm nhiễu giữa các lỗ.

Gen nội sâm là đa bản sao và sự khác biệt với telomere giảm.

3. Thuận tiện: Hoạt động đơn giản, không cần bước điện di.

4. Định lượng: △ Giá trị CT, có thể định lượng phát hiện chiều dài tương đối của telomere.

　　Phát hiện chiều dài telomereĐây là một xét nghiệm tương đối đơn giản và không đòi hỏi nhiều DNA ban đầu (khoảng 50 ng). Tỷ lệ T/S, tỷ lệ này tỷ lệ với TL trung bình (Telomere Length, chiều dài telomere), được tính bằng cách đo tín hiệu telomere (T) so với tín hiệu gen đơn bản tham chiếu (S), do đó có thể được sử dụng để xác định TL tương đối. Vì bản chất của kỹ thuật này có thể được áp dụng cho phát hiện thông lượng cao, nó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu dân số quy mô lớn. Tuy nhiên, vì Q-PCR chỉ cung cấp định lượng tương đối, dữ liệu thường không được trình bày theo chiều dài telomere tuyệt đối ở dạng kb trừ khi được so sánh với các dòng tế bào tham chiếu có TL trung bình được xác định bằng phương pháp khác. Các nghiên cứu cho thấy hệ số biến thiên của phương pháp này có thể cao hơn 10%. Và kết quả có thể khác nhau đáng kể giữa các phòng thí nghiệm khác nhau do việc sử dụng các gen đơn bản khác nhau. Q-PCR không cung cấp thông tin về telomere ngắn nhất. Cuối cùng, Q-PCR được sử dụng để đo TL có thể không thích hợp cho nghiên cứu ung thư, trong đó các gen đơn bản có liên quan có thể bị sao chép hoặc mất do không nguyên vẹn. Do đó, sự phù hợp của Q-PCR bị hạn chế đối với các mẫu có lưỡng bội bình thường và ổn định nucleotype.

Telomere là chuỗi lặp lại chuỗi không mã hóa (TTAGGG) n ở cuối nhiễm sắc thể tuyến tính của tất cả các động vật có xương sống. Sự nhô ra của sợi đơn 3'cuối telomere xâm nhập vào DNA sợi kép, tạo thành vòng T, cũng dẫn đến sự dịch chuyển chuỗi, tạo ra vòng telomere D sợi đơn. Vòng T là một cấu trúc đặc biệt của telomere liên kết trực tiếp hoặc gián tiếp với phức hợp protein bảo vệ telomere Shelterin, bảo vệ đầu cuối của nhiễm sắc thể khỏi bị nhận ra là đứt sợi kép DNA.

Telomere là một cấu trúc đặc biệt ở cuối nhiễm sắc thể của tế bào nhân chuẩn bao gồm một trình tự DNA lặp đi lặp lại và một protein gắn telomere đặc biệt, trong đó telomere của động vật có xương sống được tạo thành từ chuỗi ngắn, chuỗi lặp lại chuỗi ttaggg giàu g. Telomere có khả năng ngăn chặn sự suy thoái, hợp nhất và sắp xếp lại các đầu của nhiễm sắc thể, do đó duy trì tính độc lập, toàn vẹn và ổn định của nhiễm sắc thể. Mặc dù không có chức năng mã hóa, telomere được các nhà khoa học gọi là "đồng hồ của sự sống" vì độ dài và sự ổn định của chúng kiểm soát tuổi thọ của tế bào và có liên quan chặt chẽ đến ung thư và lão hóa của tế bào.

Trong các tế bào cơ thể bình thường của con người, chiều dài telomere sẽ dần dần rút ngắn với sự phân chia tế bào, mỗi lần phân chia tế bào, chiều dài telomere rút ngắn một đoạn, mất 20~30 nucleotide, khi telomere rút ngắn đến một mức độ nhất định, nó sẽ gây ra sự vắng mặt của cấu trúc nucleoprotein, kích hoạt sự lão hóa sao chép, xuất hiện hiện hiện hiện tượng tăng sinh tế bào chậm, trì trệ tăng trưởng, giảm khô, mất khả năng phân biệt và các hiện tượng khác. Đồng thời, sự mất mát của một số protein gắn kết đặc biệt telomere trên telomere rút ngắn cũng có thể khiến các tế bào xác định sai các đầu telomere là các vị trí đứt gãy DNA, do đó bắt đầu chức năng sửa chữa DNA, dẫn đến sự hợp nhất cuối giữa các nhiễm sắc thể telomere ngắn, sự hợp nhất của nhiễm sắc thể gây ra nguyên phân tế bào bất thường, chu kỳ tế bào bị đình trệ, do đó gây ra apoptosis do protein p53 gây ra.

Ngoài ra, đột biến gen như p53 dẫn đến các tế bào bị khiếm khuyết tại điểm phát hiện chu kỳ tế bào sẽ nhảy qua quá trình lão hóa nhân bản, tiếp tục phân chia và cuối cùng bước vào giai đoạn khủng hoảng, trong đó rất ít tế bào biểu hiện telomerase, kích hoạt hoạt động telomerase, sửa chữa và duy trì chiều dài telomere của tế bào, khiến tế bào bất tử hóa thành tế bào ung thư. Sự rút ngắn quá mức telomere và hoạt động telomerase được tìm thấy trong 90% các tế bào ung thư như ung thư trực tràng, vú, ung thư phổi, tuyến tiền liệt, v.v. Các bệnh gây ra bởi telomere bất thường cũng bao gồm bệnh bạch cầu, thiếu máu bất sản, myelodysplasia và keratosis bẩm sinh, trong số những người khác. Telomere đóng một vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình lão hóa và phát sinh bệnh tật của con người, sự thay đổi chiều dài của chuỗi telomere lặp đi lặp lại quyết định số phận của tế bào.Phát hiện chiều dài telomereLà phương pháp thí nghiệm quan trọng trong nghiên cứu sinh học telomere.

Hơn nữa,Phát hiện chiều dài telomereNó cũng có giá trị chẩn đoán quan trọng trong các bệnh lão hóa và khối u. Do sự khác biệt giữa các loài, chiều dài telomere của nhiễm sắc thể người (thường là 0,5-20kb) nhỏ hơn nhiều so với hầu hết các sinh vật mô hình phòng thí nghiệm; Và mức độ rút ngắn telomere trong các tế bào khác nhau ở các cá nhân khác nhau là khác nhau, mức độ rút ngắn telomere của các nhiễm sắc thể khác nhau trong tế bào cũng khác nhau; Các telomere có chiều dài nhỏ hơn 3kb được định nghĩa là telomere ngắn, và telomere ngắn nhất, chứ không phải chiều dài telomere trung bình, đóng một vai trò quan trọng trong việc mất chức năng telomere, gây tổn thương DNA và hạn chế sự tồn tại của tế bào. Do đó, cần có một phương pháp có thể phát hiện độ dài telomere và tỷ lệ telomere ngắn ở người với độ chính xác, đơn giản, nhanh chóng và thông lượng cao ở một mức nhiễm sắc thể duy nhất.

Trong sự phát triển của các bệnh di truyền liên quan đến telomere, khi các telomere ngắn hơn có thể dẫn đến khởi phát sớm của bệnh. Khi nghiên cứu tiếp tục đi sâu hơn, người ta cũng nhận ra rằng các yếu tố lối sống như béo phì, hút thuốc, thiếu tập thể dục và căng thẳng mãn tính có thể ảnh hưởng đến chiều dài telomere trong các tế bào bạch cầu máu ngoại vi. Ngoài ra, sự rút ngắn telomere dẫn đến rối loạn chức năng telomere có liên quan đến nhiều bệnh liên quan đến tuổi tác như vô sinh, viêm khớp, tiểu đường, ung thư, bệnh tim mạch và thoái hóa thần kinh. Do đó, điều quan trọng là các phương pháp xác định chiều dài telomere ổn định và lặp đi lặp lại có thể dự đoán sự xuất hiện của các bệnh này.

Tuy nhiên, về cơ bản tất cả các nghiên cứu dân số quy mô lớn về các bệnh liên quan đến telomere về cơ bản là các nghiên cứu tương quan và chỉ cung cấp thông tin về chiều dài trung bình hoặc chiều dài telomere tương đối. Có rất nhiều bằng chứng cho thấy telomere ngắn nhất kích hoạt phản ứng tổn thương DNA, dẫn đến lão hóa nhân bản ở động vật có vú. Chiều dài telomere ngắn nhất là một dấu ấn sinh học quan trọng quyết định số phận của tế bào và sự khởi đầu của quá trình lão hóa, nhưng các phương pháp phát hiện telomere ngắn tốn thời gian và không đạt được yêu cầu thông lượng cao. Cho nên phương pháp đo chiều dài telomere hiện có không phân biệt ưu khuyết, mỗi người một vẻ.

Những thay đổi bất thường về chiều dài telomere có thể xảy ra sớm trong bệnh, và trong nhiều thập kỷ, nó có thể là một chỉ số sàng lọc sớm cho một số bệnh hoặc thậm chí là một chỉ số chẩn đoán hoặc đánh giá tiên lượng bổ sung. Các xét nghiệm thông lượng cao đơn giản và dễ thực hiện có thể được sử dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học của quần thể lớn để tìm các bệnh liên quan đến telomere và các xét nghiệm chính xác hơn cung cấp sự phân bố chiều dài telomere khác nhau có thể được sử dụng để tìm các cơ chế có thể giữa chiều dài telomere và các bệnh liên quan; Đương nhiên, phương pháp phát hiện telomere vừa thông lượng cao vừa chính xác vừa có thể cung cấp thông tin nhiều mặt càng nên trở thành mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi.