(Dịch vụ thử nghiệm) PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực

1. Tổng quan về dịch vụ

(Dịch vụ thử nghiệm) PCR định lượng huỳnh quang thời gian thựcQuantitative Real-time PCR (qPCR) đề cập đến việc bổ sung các nhóm huỳnh quang vào hệ thống phản ứng khuếch đại PCR, theo dõi toàn bộ quá trình PCR trong thời gian thực bằng cách tích lũy tín hiệu huỳnh quang và cuối cùng là phân tích định lượng các mẫu không xác định thông qua các đường cong tiêu chuẩn. Là một công nghệ "tiêu chuẩn vàng" trong nghiên cứu sinh học phân tử, qPCR đã trở thành một công cụ để phân tích biểu hiện gen, phát hiện mầm bệnh và nghiên cứu các biến thể di truyền nhờ độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác của nó.

Chúng tôi dựa vào nền tảng kiểm tra PCR để cung cấpMẫu chiết xuất axit nucleic, phiên mã ngược, qPCR khuếch đại để phân tích dữ liệuDịch vụ kỹ thuật một cửa. Cho dù bạn cần kiểm tra mức độ biểu hiện của mRNA, miRNA, lncRNA hoặc thực hiện phân tích biến thể số bản sao DNA (CNV), chúng tôi có thể cung cấp cho bạn dữ liệu chất lượng cao đáp ứng các tiêu chuẩn.

2. Nguyên tắc và phương pháp kỹ thuật

Chúng tôi cung cấp hai chiến lược phát hiện chính để đáp ứng các nhu cầu thử nghiệm khác nhau:

• Phương pháp nhuộm SYBR Green I:

• Nguyên tắc:Thuốc nhuộm SYBR Green I đặc biệt liên kết với các rãnh nhỏ của DNA sợi kép, sau khi liên kết với tín hiệu huỳnh quang được tăng cường. Khi sản phẩm PCR tăng lên, đồng bộ hóa tín hiệu huỳnh quang được tăng cường.

• Áp dụng:Sàng lọc sơ bộ cho sự khác biệt về biểu hiện gen, xét nghiệm mẫu quy mô lớn, các dự án nhạy cảm về chi phí. Chúng tôi hợp tác với phân tích Melt Curve để đảm bảo tính đơn nhất của sản phẩm khuếch đại.

• Phương pháp thăm dò TaqMan:

• Nguyên tắc:Sử dụng đầu dò cụ thể được thiết kế cho trình tự mục tiêu (nhóm báo cáo huỳnh quang được đánh dấu ở đầu 5'và nhóm dập tắt được đánh dấu ở đầu 3'). Không có huỳnh quang khi đầu dò còn nguyên vẹn, và quá trình thủy phân của enzyme Taq trong quá trình khuếch đại cắt các nhóm huỳnh quang, phát ra huỳnh quang.

• Áp dụng:Độ đặc hiệu cao đòi hỏi thử nghiệm, kiểm tra đa PCR (Multiplex PCR), phân loại SNP, kiểm tra mẫu dấu vết.

3. Nội dung dịch vụ và toàn bộ quá trình

Chúng tôi tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP) để đảm bảo kiểm soát chính xác từng bước:

Giai đoạn 1: Thiết kế thử nghiệm và tối ưu hóa

• Thiết kế mồi/đầu dò:Thiết kế các mồi transintron cho gen mục tiêu (Target Gene) để tránh sự can thiệp của ô nhiễm DNA bộ gen; Sàng lọc gen nội sâm (Housekeeping Gene, như GAPDH, ACTB, 18S rRNA, v.v.).

• Kiểm tra trước khi thử nghiệm:Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng điện di PCR và gel agarose thông thường để tối ưu hóa nhiệt độ ủ.

Giai đoạn 2: Xử lý mẫu

• Chiết xuất axit nucleic:Đối với các loại mẫu khác nhau (tế bào, mô, máu, exosome, v.v.), tổng RNA hoặc DNA chất lượng cao được chiết xuất bằng bộ dụng cụ đặc biệt để kiểm tra nồng độ và độ tinh khiết (OD260/280) và đánh giá tính toàn vẹn.

• Phiên mã ngược (tổng hợp cDNA):Sử dụng Oligo (dT) hoặc mồi ngẫu nhiên chống lại mRNA; Sử dụng mồi vòng thân hoặc phương pháp đuôi cho miRNA để đảm bảo hiệu quả phiên mã ngược đồng đều.

Giai đoạn 3: Kiểm tra trên máy bay

• Xây dựng hệ thống:Cấu hình hệ thống phản ứng qPCR có độ trung thực cao, thiết lập ít nhất 3 lần lặp lại kỹ thuật (Triplicates), loại bỏ lỗi thêm mẫu.

• Chương trình đang chạy:Tín hiệu huỳnh quang được thu thập trong thời gian thực, tạo ra một đường cong khuếch đại.

Giai đoạn 4: Phân tích dữ liệu

• Định lượng tương đối:Áp dụng2−ΔΔCtPhương pháp tính toán sự khác biệt trong biểu hiện gen so với nhóm đối chứng fold change.

  
  

• Định lượng:Xây dựng tiêu chuẩn plasmid, vẽ các đường cong tiêu chuẩn và tính toán số bản sao chính xác của gen mục đích trong mẫu.

  
  

4. Lợi thế cốt lõi của chúng tôi

1. Nền tảng phần cứng:Máy đo PCR định lượng chính, sự khác biệt giữa các lỗ là rất nhỏ và độ ổn định dữ liệu cao.

2. Hệ thống kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt:Theo dõi quốc tế MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） Hướng dẫn. Giám sát chặt chẽ hiệu quả khuếch đại (90% -110%) và quan hệ tuyến tính (R²>0,99) để loại bỏ dương tính giả/âm tính giả.

3. Xử lý mẫu phức tạp:Với kinh nghiệm phong phú về cắt lát FFPE, mô vi lượng, exosome và xử lý mẫu máu toàn phần, loại bỏ hiệu quả các chất ức chế PCR.

4. Giao dữ liệu chuyên nghiệp:Không chỉ cung cấp giá trị Ct ban đầu mà còn cung cấp biểu đồ khuếch đại, biểu đồ tan chảy, biểu đồ cột/nhiệt biểu hiện tương đối và tạo báo cáo đầy đủ với các vật liệu và phương pháp thí nghiệm chi tiết, đáp ứng trực tiếp các yêu cầu xuất bản của SCI.

5. Áp dụng kịch bản

• Phân tích mức độ biểu hiện gen:Xác minh biểu hiện khác biệt của mRNA, lncRNA, circRNA dưới các điều kiện xử lý khác nhau hoặc mô hình bệnh (xác minh qPCR sau RNA seq).

• Xét nghiệm miRNA:Nghiên cứu quy định biểu hiện của microRNA.

• Biến thể số lượng bản sao DNA (CNV):Xét nghiệm khuếch đại hoặc thiếu gen khối u, xác định số bản sao biến đổi gen.

• Xác minh phân loại SNP:Xác định kiểu gen của các vị trí đa hình đơn nucleotide.

• Xét nghiệm vi sinh vật gây bệnh:Xác định tải lượng virus, phân tích định lượng vi khuẩn.

• ChIP-qPCR:Các mảnh DNA sau khi kết tủa miễn dịch nhiễm sắc tố được làm giàu để xác minh, nghiên cứu tương tác protein-DNA.

6. Yêu cầu gửi mẫu và tiêu chuẩn giao hàng

• Đề nghị gửi mẫu:

• Tế bào: Lượng mưa tế bào>

• 1*10^6， Đóng băng nhanh sau khi làm sạch PBS.

• Tổ chức:Mô động vật>50mg, mô thực vật>100mg, đông lạnh nitơ lỏng hoặc bảo quản RNAlater

• Máu:Toàn bộ máu cần xử lý chống đông máu hoặc trực tiếp cung cấp huyết thanh/huyết tương đã được phân lập.

• RNA và DNA:Nồng độ>50ng/μL, tổng lượng>1μg, vận chuyển đá khô.

• Nội dung giao hàng:Báo cáo thử nghiệm đầy đủ (bao gồm các bước thử nghiệm, thông tin về thuốc thử), tệp dữ liệu gốc (.eds/.xls), biểu đồ kết quả phân tích dữ liệu (bảng thống kê Excel và hình ảnh HD).