pBLUE-T Simple Carrier Bộ dụng cụ nhân bản nhanh Nguyên tắc T4

pBLUE-T Đơn giảnVận chuyển nhanh Clone Kit

pBLUE-T Simple Carrier Bộ dụng cụ nhân bản nhanh Nguyên tắc T4

Số thư mục:42119

Bộ thành phần, lưu trữ, ổn định:

Lưu trữ 20 ℃, trong vòng 6 tháng không ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng.

Giới thiệu sản phẩm:

pBLUE-T Simple Vector là một phương tiện chuyên dụng cho các sản phẩm PCR nhân bản hiệu quả cao (TA Cloning). Chất mang này được chuyển đổi từ plasmid pBlueScript II SK (+), khác với phương pháp T truyền thống ECOR V sau khi cắt, pSURE-T Simple thông qua việc chuyển đổi pBlueScript II SK (+), sau khi giới thiệu enzyme Xcm I tại vị trí đa dòng pBlueScript II SK (+) để tạo ra các base T chưa ghép nối trực tiếp ở đầu 3'ở hai bên của vị trí đa dòng ban đầu, do đó có hiệu quả tái tổ hợp cao hơn. Đồng thời, nó loại bỏ các vị trí cắt enzyme đa dòng trên vectơ pBlueScript II SK (+), đòi hỏi phải nhập các vị trí cắt enzyme thích hợp trên mồi khuếch đại PCR. Tại thời điểm này, nếu sử dụng PCR khuếch đại dẫn vào vị trí cắt enzyme để thực hiện cắt enzyme DNA, phản ứng cắt enzyme sẽ không bị ảnh hưởng bởi các enzyme hạn chế trên các vị trí cắt enzyme đa dòng khác trên tàu sân bay T, có thể cải thiện đáng kể hiệu quả cắt enzyme và tăng công suất acrlon. Ngoài ra, hệ thống kết nối tàu sân bay của công ty còn có nền thấp (đốm xanh nhỏ hơn 10%), tỷ lệ tổ chức lại cao (hơn 90% trong đốm trắng có đoạn chèn), có thể kết nối nhanh chóng và các đặc điểm khác. Thông tin kỹ thuật liên quan đến vector pBLUE-T Simple được liệt kê ở cuối hướng dẫn này, trình tự đầy đủ có thể tham chiếu đến trình tự pBlueScript II SK (+), chỉ khác một chút ở vị trí cắt enzyme đa dòng của nó.

Giải trình tự được khuyến nghị sử dụng mồi giải trình tự chung M13 và mồi khởi động T3 (xem biểu đồ sau)
Quy trình thực hiện:
1. Chuẩn bị cho phản ứng kết nối

Việc sản phẩm PCR có được tinh chế hay không phụ thuộc vào chất lượng của sản phẩm khuếch đại. Nếu sản phẩm PCR rất sạch, phản ứng kết nối có thể được thực hiện trực tiếp mà không cần tinh chế. Nhưng nếu nó là một sản phẩm PCR với plasmid làm khuôn mẫu, nó phải được tinh chế, và plasmid khuôn mẫu có thể cũng hình thành các đốm trắng. Các sản phẩm PCR có thể được phân lập bằng điện di gel agarose. Bộ dụng cụ phục hồi tinh khiết nhanh các sản phẩm DNA được sản xuất bởi công ty có thể phục hồi tốt các đoạn DNA trên 70bp.

Các sản phẩm PCR được khuếch đại bởi Taq, Tth, AmpliTaq, KlenTaq DNA polymerase, tất cả đều có một điểm 3 nổi bật ở cuối.-a) Có 3-Các sản phẩm PCR ở cuối A có thể được nhân bản trực tiếp với vectơ pBLUE-T Simple. với 3'®Sản phẩm PCR khuếch đại DNA polymerase (High Fidelity Enzyme) hoạt động của 5'exceplase là kết thúc bằng phẳng, để nhân bản sản phẩm PCR kết thúc bằng phẳng này, trước tiên phải tiến hành 3'­-Kết thúc cộng với một công việc.

2. Phản ứng kết nối thông thường:

1) Trong một tiêu chuẩn 10mKết nối với hệ thống phản ứng, thêm 1mL 30% pblue-t đơn giảnmSản phẩm PCR (trong điều kiện thông thường, không cần phải định lượng chính xác sản phẩm PCR, tỷ lệ mol của sản phẩm PCR nói chung được tối ưu hóa thành 2: 1~10: 1 để có được kết quả tốt, khuyến nghị 3: 1), 1ml 10´Ligation Buffer và 0.5-1mL (2,5-5 Weiss Units) T4 DNA Ligase, phần còn lại được bổ sung bằng nước. Phản ứng được thực hiện theo hệ thống sau:

Kết quả tìm kiếm cho "T4 DNA Ligase"

2) 16 ℃ kết nối qua đêm (thường có thể được thực hiện trong thiết bị PCR).

Thông thường đề nghị kết nối 16 ℃ qua đêm (10)mSố lượng ligase tiêu chuẩn của hệ thống là 2,5 Weiss Units, cho phép chuyển đổi nhiều nhất. Tuy nhiên, hệ thống này chứa PEG Enhancer có thể cải thiện hiệu quả kết nối gấp nhiều lần, trong trường hợp có lượng enzyme kết nối cao (10).ml Hệ thống đề nghị số lượng kết nối là 5 Weiss Units) 16 ℃ kết nối 30 phút có thể đạt được yêu cầu nghiên cứu chung.

3) Băng được làm lạnh và sau đó được chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ° C.

3. Phản ứng kết nối nhanh:

1) Phản ứng được thực hiện theo hệ thống sau:

Kết quả tìm kiếm cho "T4 DNA Ligase"

2) 22 ℃ kết nối 5-10 phút (thường có thể được thực hiện trong thiết bị PCR).

2 ´Quick Ligation Buffer đã bao gồm tất cả các thành phần kết nối nhanh được tối ưu hóa, thường được khuyến nghị cho kết nối 22 ℃ trong 10 phút.mLượng enzyme kết nối hệ thống là 5 Weiss Units, kết nối dài có thể kéo dài đến 30 phút) thường có kết quả đạt yêu cầu. Ngoài ra, hệ thống này cũng có thể được kết nối ở 16 ℃ trong 30 phút (10)mSố lượng enzyme kết nối hệ thống là 5 Weiss Units) đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu chung.

3) Băng được làm lạnh và sau đó được chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ° C.

4. Chuyển đổi:

ở 50-100ml Các tế bào trạng thái cảm nhận, đặt trên băng, sau khi tan băng hoàn toàn, phủi nhẹ vài lần để treo các tế bào đồng đều.

ở Tham gia 4-5mDịch kết nối (tối đa có thể được thêm vào, miễn là thể tích không vượt quá 1/10 thể tích tế bào trạng thái cảm nhận), trộn đều nhẹ nhàng. Để trên băng trong 30 phút. Tắm nước nóng 42 độ C kích thích 90 giây. Để trên băng 2-3 phút.

ở Thêm 500.mMôi trường LB hoặc SOC (không có kháng sinh), nuôi cấy dao động 37 ℃ 150 vòng/phút trong 60 phút.

ở 200.ml Lớp phủ vi khuẩn trước khi sử dụng 16ml 50mg/ml IPTG và 40ml 20 mg/ml X-gal tráng trên tấm ampicillium su.

Lượng vi khuẩn phủ được điều chỉnh phù hợp dựa trên hiệu quả kết nối và tỷ lệ thụ thể của tế bào thụ thể, nếu nhân bản dự kiến ít hơn, một phần của dịch nuôi cấy có thể được hút bằng ly tâm (4.000 vòng/phút, 2 phút), để lại một lượng thích hợp của vi khuẩn đình chỉ sau khi lấy toàn bộ hoặc bôi vừa phải trong một tấm phẳng (bôi dung dịch vi khuẩn còn lại có thể được đặt ở 4 độ để bảo quản, ngày thứ hai nếu số lượng vi khuẩn chuyển đổi ít, có thể bôi toàn bộ dung dịch vi khuẩn còn lại lên một tấm nuôi cấy mới).

ở Các tấm phẳng được đặt theo hướng tích cực ở 37 ° C trong 1 giờ để hấp thụ chất lỏng dư thừa, sau đó được trồng ngược qua đêm.

5 Lọc:

1). Sàng lọc màu xanh trắng cho Translator:

Khi một đoạn DNA ngoại sinh được đưa vào pBLUE-T Simple, mã hóa của gen LacZ đã bị thay đổi do sự hiện diện của trình tự axit nucleic của DNA ngoại sinh, do đó ảnh hưởng đến sản phẩm của nó.b-Namea-Hoạt động của các phân đoạn, do đó các bản sao tái tổ hợp xuất hiện màu trắng trên các tấm X-gal/IPTG thay vì màu xanh trên các bản sao không tái tổ hợp. Đôi khi các đoạn chèn không ảnh hưởng đến khung đọc gen lacZ, hoặc các đoạn chèn quá nhỏ, trong trường hợp này các thuộc địa (nhân bản tái tổ hợp) xuất hiện màu xanh nhạt hoặc các đốm màu xanh nhạt ở trung tâm của các thuộc địa và vòng ngoài màu trắng (mắt cá). Chọn các thuộc địa màu trắng hoặc màu xanh nhạt phát triển trên tấm IPTG/X-gal, chọn môi trường lỏng có chứa ampicillium su bằng tăm, nuôi qua đêm ở 37 ° C.

2). Xác định chất chuyển hóa:

a. Plasma được rút ra bằng dịch nấm của các thuộc địa màu trắng được nuôi cấy ở trên, được cắt bằng enzyme với các đoạn chèn, và điện di gel agarose kiểm tra kích thước của đoạn để xác định xem nó có chứa đoạn đích hay không.

b. Chọn các thuộc địa màu trắng để kiểm tra PCR trực tiếp

c. Xác định xem có chứa nhân bản mục đích hay không bằng cách sử dụng mồi khởi động T3 hoặc mồi giải trình tự chung M13.

ở Làm thế nào để tính toán số lượng sản phẩm PCR cần thiết trong phản ứng kết nối?

Nói chung, tối ưu hóa tỷ lệ mol của sản phẩm PCR và chất mang đến 2: 1~10: 1 (khuyến nghị 3: 1) cho kết quả tốt, có thể sử dụng công thức sau:

[Lượng vectơ được thêm vào (ng) × Kích thước mảnh chèn (kb) ÷ Kích thước vectơ (kb)] × Tỷ lệ mol của mảnh chèn và mảnh mang=Lượng mảnh được chèn vào (ng) Ví dụ: Tỷ lệ mol của mảnh chèn và kết nối vectơ là 3: 1, chẳng hạn như khi người mang 40ng được thêm vào phản ứng kết nối và kích thước mảnh chèn là 1000bp, tại thời điểm đó phần chèn nên được thêm vào là [40ng vectơ × 1kb mảnh chèn ÷ 2,928kb vectơ] × 3/1=40,1ng.

pBLUE-T Simple Carrier Bộ dụng cụ nhân bản nhanh Nguyên tắc T4