Một bước Gibson Cloning Kit

Một bước Gibson Cloning Kit

(Có thể kết nối 1-5 mảnh)

Một bước Gibson Cloning Kit

Số thư mục:42112

Khối lượng gói:

Lưu trữ sản phẩm:-20°CBảo quản, tránh đóng băng và tan chảy lặp đi lặp lại

Mô tả sản phẩm: Sản phẩm này không phụ thuộc vàoT4Kết nối enzyme, không bị giới hạn bởi các vị trí cắt enzyme của các phần mang và mục đích, trong khi phương pháp tái tổ hợp trực tiếp với các phần chồng chéo, sử dụng sự kết hợp enzyme đặc biệt có thể tuyến tính hóa các phương pháp tùy ý của vectơ và cả hai đầu của nó có15-25bpVùng chồng chéoPCRFragment (Flat End) tổ chức lại định hướng, có thể được thực hiện nhanh chóng1-5Một bản sao hiệu quả cao.

Tính năng sản phẩm:

1. 30Một phút có thể dài hoặc ngắn.PCRCác mảnh khuếch đại (đầu phẳng) được đưa vào tàu sân bay.

2. Không phụ thuộc vào sự sẵn có của các vị trí cắt enzyme của vectơ và mảnh chèn và đầu phẳng của vectơ/Giới hạn ở cuối cùng của tính díu, bạn có thể nhân bản tại bất cứ vị trí nào.

3.Nhân bản liền mạch, các điểm chèn không giới thiệu các chuỗi cơ sở không mong muốn.

4.Hiệu quả cao, chính xác, tỷ lệ dương tính>95%。

Chuẩn bị các vectơ tuyến tính và các mảnh DNA chèn:

A: Chuẩn bị tàu sân bay tuyến tính

(1). Nguồn cắt enzyme:Enzyme cắt được chất mang tuyến tính, đầu phẳng hoặc đầu dính, cắt đơn hoặc cắt đôi đều có thể, sau khi cắt keo thu hồi.

Lưu ý: Không có chuỗi DNA ligase trong hệ thống phản ứng nối liền mạch và nhân bản, sẽ không xảy ra phản ứng tự kết nối vector. Do đó, ngay cả các vectơ tuyến tính được chuẩn bị theo phương pháp cắt đơn enzyme cũng không cần xử lý triệt để. Các bản sao dương tính giả (không có mảnh chèn) xuất hiện sau khi chuyển đổi sản phẩm tái tổ hợp được hình thành bởi sự chuyển đổi của các vectơ vòng không tuyến tính hoàn toàn của enzyme. Chúng tôi khuyên rằng việc thu hồi keo sau khi cắt enzyme có thể làm giảm tỷ lệ chất mang không tuyến tính này xuống mức thấp hơn.

(2). Nguồn PCR ngược:Đề nghị sử dụng polymerase DNA có độ trung thực cao (Mã hàng: P517-05) để chuẩn bị, nếu dải khuếch đại đơn lẻ có thể thu được tàu sân bay bằng cách tinh chế sản phẩm PCR (Mã hàng: DC012-100), nếu không sẽ thu được tàu sân bay bằng cách thu hồi keo (Mã hàng: DC011-100).

Lưu ý: Mẫu plasmid của PCR đảo ngược cũng là một chất mang phi tuyến tính và cũng có thể dẫn đến nhân bản dương tính giả (không có mảnh chèn), do đó mẫu plasmid được tiêu hóa với enzyme nội tiếp Dpn I trước khi tinh chế chất mang tuyến tính nguồn PCR (sản phẩm PCR), có thể làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính. Nhưng nói chung, sau khi tái chế keo đã đủ để giảm tỷ lệ tàu sân bay không tuyến tính này xuống thấp hơn zui, vì vậy các tàu sân bay tuyến tính của nguồn PCR đảo ngược chúng tôi cũng khuyên bạn nên tái chế keo.

B: Chuẩn bị các mảnh DNA chèn vào

(1). Thiết kế mồi nhân bản phân đoạn riêng lẻ: mồi nhân bản bao gồm một chuỗi mồi đặc trưng của phân đoạn chèn và một chuỗi chồng chéo.

Nhân bản chuyển tiếp mồi (5'-3'): chuyển tiếp vector tuyến tính 16-25 nt chồng chéo khu vực chuỗi (tính từ cuối 3')+chèn đoạn chuyển tiếp cụ thể mồi chuỗi (18-25 nt)

Clone Reverse mồi (5'-3'): Linear Carrier Reverse 16-25 nt chồng chéo vùng trình tự (tính từ cuối 3')+Chèn đoạn ngược cụ thể mồi trình tự (18-25 nt)

Chú ý:Các vùng chồng chéo có cơ sở kiềm ít nhất 16 bp và giá trị Tm giữa các vùng chồng chéo nhiều đoạn phải nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C), nếu không số lượng cơ sở có thể được kéo dài cho đến khi đáp ứng yêu cầu.

Theo cấu trúc của kết thúc vận chuyển tuyến tính (5'nhô ra, 3'nhô ra, kết thúc bằng phẳng), thiết kế mồi cũng được chia thành 3 trường hợp.

Cả hai đầu của tàu sân bay tuyến tính bởi vì các phương pháp tuyến tính (chẳng hạn như cắt đơn enzyme, cắt kép, PCR đảo ngược) khác nhau, có thể là bất kỳ sự kết hợp nào của hai hoặc hai cấu trúc cuối của ba loại trên. Nguyên tắc thiết kế mồi cụ thể của mảnh chèn tuân theo nguyên tắc thiết kế mồi chung là ok.

Khi tính toán nhiệt độ ủ mồi khuếch đại, chỉ cần tính giá trị Tm của trình tự khuếch đại đặc hiệu gen và trình tự tương đồng đầu cuối của vectơ không nên tham gia vào tính toán.

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, bắt đầu từ đầu 3'và quay trở lại 16bp-25bp (ví dụ này sử dụng kết thúc 20 bp chồng chéo cùng một chuỗi), thêm vào phía trước của chuỗi mồi cụ thể của đoạn mục tiêu. Đảm bảo rằng các giá trị Tm của các vùng chồng chéo vẫn nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C).

Dẫn chuyển tiếp cụ thể như sau: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNhà hàng 3'

Lưu ý: Sau khi thiết kế mồi trên hoàn thành kết nối nhân bản, vết cắt enzyme EcoR I sẽ biến mất (không giữ lại vết cắt enzyme).

Nếu cần giữ Vị trí cắt enzyme EcoR I, yêu cầu bổ sung trình tự vị trí nhận dạng EcoR I bị thiếu aattc giữa trình tự chồng chéo 20 bp ở cuối vectơ và trình tự mồi cụ thể phân đoạn mục đích,Sau khi kết nối nhân bản hoàn tất, vết cắt enzyme EcoR I vẫn còn (giữ lại vết cắt enzyme).

Cụ thể như sau: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Các vectơ được cắt bởi enzyme Hind III để tạo thành một đầu nhô ra 5':

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, bắt đầu từ đầu 3'và quay trở lại 16bp-25bp (ví dụ này sử dụng kết thúc 20 bp chồng chéo cùng một chuỗi), thêm vào phía trước của chuỗi mồi cụ thể của đoạn mục tiêu. Đảm bảo rằng các giá trị Tm của các vùng chồng chéo vẫn nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C).

Đảo ngược mồi cụ thể như sau: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANhà hàng 3'

LƯU Ý: Sau khi thiết kế mồi trên hoàn thành kết nối nhân bản, tiếp tuyến Hind III sẽ biến mất (không giữ lại tiếp tuyến enzyme).

Nếu cần giữ Vị trí cắt enzyme Hind III, yêu cầu bổ sung trình tự vị trí nhận dạng Hind III bị thiếu agctt giữa trình tự chồng chéo 20 bp ở cuối vectơ và trình tự mồi cụ thể của phân đoạn đích ，Vết cắt enzyme Hind III vẫn còn (vết cắt enzyme được giữ lại).

Cụ thể như sau: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA Agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(2). Thiết kế mồi nhân bản của nhiều mảnh chèn: Phương pháp thiết kế mồi đoạn chèn được kết nối với cả hai đầu của tàu sân bay cùng một phương pháp thiết kế mảnh đơn

* Nhiều vùng chồng chéo giữa các mảnh chèn được thiết kế theo hai cách * đánh dấu (màu xanh và màu đỏ) ở trên, khi thiết kế mồi nhiều mảnh, hãy chọn bất kỳ cách nào hoặc kết hợp cả hai, đảm bảo rằng có một vùng chồng chéo 15-25bp giữa các mảnh và mảnh.

(3). Lựa chọn enzyme: Khuyến nghị sử dụng DNA polymerase có độ trung thực cao hoặc PCR Mix (P517-05 hoặc P814-05).

(4). Điều kiện phản ứng: thường được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng polymerase cụ thể.

(5). Phân đoạn chèn tinh khiết

lTùy chọn:Nếu mảnh vỡ có nguồn gốc từ mẫu plasmid và plasmid này có sức đề kháng tương tự như chất mang tái tổ hợp, việc tiêu hóa mẫu plasmid với enzyme endoclease Dpn I trước khi tinh chế có thể làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính.

lNếu mảnh duy nhất, nó được khuyến khích để tinh chế mảnh với bộ dụng cụ tinh chế sản phẩm PCR (số 43012-100).

LNếu có sự khuếch đại không đặc hiệu, nên thu hồi các mảnh bằng bộ dụng cụ thu hồi keo (số 43011-100).

LSử dụng phương pháp nhân bản này, vị trí cắt enzyme được sử dụng để tuyến tính hóa chất mang sẽ bị thiếu khi nối, nếu có yêu cầu nghiêm ngặt về vị trí cắt enzyme, đề nghị Chú ý đến việc lựa chọn vị trí cắt enzyme, nếu cần thiết có thểGiữa trình tự vùng chồng chéo và trình tự gen cụ thể của mồi nhân bản chuyển tiếp và ngượcTăng cơ sở bị thiếu để khôi phục vị trí cắt enzyme ban đầu (xem ví dụ về thiết kế mồi tích cực và ngược).

LNếu plasmid tái tổ hợp được sử dụng để biểu hiện protein, hãy chú ý đến khung đọc khi thiết kế mồi, và các trình tự cần thiết để biểu hiện và tinh chế protein (chẳng hạn như trình khởi chạy, trình tự RBS, codon bắt đầu, codon kết thúc, nhãn protein, v.v.) không bị phá hủy.

Các bước hoạt động của phản ứng clone liền mạch:

Lưu ý: 2 × Cloning Master Mix chứa chất tăng cường kết nối PEG rất dính, lấy ra khỏi tủ lạnh khi nhiệt độ thấp sẽ dính hơn, có thể đặt trong lòng bàn tay đông lạnh trong vài phút để tăng nhiệt độ có thể làm giảm độ nhớt (không ảnh hưởng đến chất lượng), ngón tayĐáy ống ly tâm trộn đều hoặc chấn động xoáy đều.

1. Thiết lập hệ thống phản ứng theo bảng dưới đây (có thể sử dụng ống PCR để điều chế ở nhiệt độ phòng)

* Carrier thường sử dụng 10-50 ng, tỷ lệ mol của mảnh chèn và vectơ là tốt nhất giữa 2: 1-3: 1; Nếu mảnh chèn nhỏ hơn 200bp, tỷ lệ mol của mảnh chèn với vectơ là 5: 1, trong trường hợp kết nối nhiều mảnh, tỷ lệ mol giữa mảnh và mảnh là 1: 1.

2. Nhẹ nhàng trộn đều, ở 50.°Phản ứng C trong 15 phút (có thể được thực hiện trên thiết bị PCR), sau khi kết thúc phản ứng, ống PCR được chuyển đổi trực tiếp hoặc lưu trữ ở -20°C. Kết nối hơn 3 mảnh, có thể kéo dài thời gian phản ứng lên đến 30 phút.

3. 5 μl sản phẩm phản ứng được lấy để chuyển đổi theo hướng dẫn của tế bào trạng thái cảm nhận (nếu có ít transistor hơn, tất cả các sản phẩm có thể được chuyển đổi và tất cả các tấm phủ dịch chuyển đổi có thể được chuyển đổi).

Xác định nhân bản dương tính:

Có thể căn cứ vào tình huống cụ thể, lựa chọn xác định PCR thuộc địa, chiết xuất plasmid (số 31011-100) để tiến hành xác định enzyme nội bào hạn chế hoặc xác định trình tự.

Một bước Gibson Cloning Kit