Zero Background Flat End Clone Kit Nguyên tắc T4

ZERO-MờZero Background Flat End Bộ dụng cụ Clone nhanh

Zero Background Flat End Clone Kit Nguyên tắc T4

Số thư mục:42018

Bộ thành phần, lưu trữ, ổn định:

Lưu trữ 20 ℃, trong vòng 6 tháng không ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng.

v Giới thiệu sản phẩm:

Zero Background Flat End Fast Connection Kit là một hệ thống nhân bản chọn lọc dương tính zikiller tuyệt vời có thể nhân bản hiệu quả các sản phẩm PCR Flat End và bất kỳ đoạn DNA nào có đầu phẳng. Bộ dụng cụ này có hiệu quả chống lại cả các đoạn DNA phosphoryl hóa hoặc không phosphoryl hóa. Kết nối Positive Selection Carrier và Insert Fragment Connection có thể nhận được hơn 95% các bản sao tái tổ hợp tích cực chỉ trong 5 phút. Các sản phẩm PCR đầu phẳng được khuếch đại bởi polymerase có hoạt tính điều chỉnh, chẳng hạn như Pfu polymerase, có thể được kết nối trực tiếp với chất mang nhân bản. Các sản phẩm liên kết có thể chuyển đổi trực tiếp các chủng E. coli thường được sử dụng.

Bộ dụng cụ cung cấp một vector nhân bản chọn lọc dương tính zikiller pZERO-Blunt mới lạ. vector này chứa các gen zikiller gây chết người (chứa các vị trí đa dòng), khi vector được kết nối thành công với các mảnh, các gen zikiller không thể biểu hiện chính xác và các tế bào chứa các reconstructor có thể phát triển bình thường; Khi vector không kết nối thành công với các mảnh vỡ, vector được biểu hiện chính xác sau khi kết nối và các tế bào chứa vector tự kết nối không thể tồn tại, đó là nền "zero zero". Chiến lược sàng lọc dương tính này không cần sàng lọc đốm xanh trắng, đẩy nhanh tiến trình sàng lọc nhân bản rất lớn.

Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc cắt enzyme và chèn các hoạt động di truyền phân đoạn, vị trí đa dòng của vectơ nhân bản pZERO-Blunt chứa một trình tự nhận dạng BglII ở mỗi bên. Ngoài ra, vector này có chứa các bộ khởi động T7 có thể được sử dụng trong các nghiên cứu như phiên mã in vivo hoặc in vitro, giải trình tự các mảnh chèn, v.v.

Quy trình thực hiện:

1. Chuẩn bị cho phản ứng kết nối:

Các sản phẩm PCR đầu phẳng hoặc các mảnh đầu phẳng sau khi cắt enzyme có thể được thu hồi bằng cách tách điện di gel agarose (sử dụng keo cắt dưới ánh sáng cực tím sóng dài hoặc keo truyền qua ánh sáng nhìn thấy để tránh tổn thương DNA gây ra kết nối thất bại). Tỷ lệ mol với vector là 3:1. Bộ dụng cụ phục hồi tinh khiết nhanh các sản phẩm DNA được sản xuất bởi công ty có thể phục hồi tốt các đoạn DNA trên 70bp.

2. Phản ứng kết nối nhanh:

1) Trong một tiêu chuẩn 10mKết nối với hệ thống phản ứng, thêm 1mL 40,<NUM>pzero cùn Ch #1ml Sản phẩm PCR (trong điều kiện thông thường, không cần phải định lượng chính xác sản phẩm PCR, tối ưu hóa tỷ lệ mol của sản phẩm PCR nói chung đến 1: 1~10: 1 để có được kết quả tốt, khuyến nghị 3: 1, xem phụ lục), 5ml 2´Quick Ligation Buffer và 0.9mL DNA Ligase T4, phần còn lại được bổ sung bằng nước khử trùng.

Phản ứng được thực hiện theo hệ thống sau:

Kết quả tìm kiếm cho "T4 DNA Ligase"

2) 22 ℃ kết nối 5-10 phút (thường có thể được thực hiện trong thiết bị PCR).

Kết nối 22 ℃ thường được khuyến nghị trong 5-10 phút, kết nối đoạn dài>3kb có thể được kéo dài đến 30 phút. Không nên vượt quá 30 phút, nhiều hơn có thể làm giảm số lượng chuyển đổi.

3) Băng được làm lạnh và sau đó được chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ° C.

3. Chuyển đổi:

1) 100ml Các tế bào trạng thái cảm nhận, đặt trên băng, sau khi tan băng hoàn toàn, phủi nhẹ vài lần để treo các tế bào đồng đều.

2) Tham gia 4-5mDịch kết nối (tối đa có thể được thêm vào, miễn là thể tích dịch kết nối không vượt quá 1/10 thể tích tế bào trạng thái cảm nhận), trộn đều nhẹ nhàng. Để trên băng trong 30 phút.

3) Tắm nước nóng 42 độ C kích thích 90 giây. Để trên băng 2-3 phút.

4) Thêm 500.mMôi trường LB hoặc SOC (không có kháng sinh), nuôi cấy dao động 37 ℃ 150 vòng/phút trong 60 phút.

5) 200.ml Vi khuẩn phủ trong Ampicillium su (100)mg/ml trên đĩa.

Lượng vi khuẩn phủ được điều chỉnh phù hợp dựa trên hiệu quả kết nối và tỷ lệ thụ thể của tế bào thụ thể, nếu nhân bản dự kiến ít hơn, một phần của dịch nuôi cấy có thể được hút bằng ly tâm (4.000 vòng/phút, 2 phút), để lại một lượng thích hợp của vi khuẩn đình chỉ sau khi lấy toàn bộ hoặc bôi vừa phải trong một tấm phẳng (bôi dung dịch vi khuẩn còn lại có thể được đặt ở 4 độ để bảo quản, ngày thứ hai nếu số lượng vi khuẩn chuyển đổi ít, có thể bôi toàn bộ dung dịch vi khuẩn còn lại lên một tấm nuôi cấy mới).

6) Các tấm phẳng được đặt theo hướng tích cực ở 37 ° C trong 1 giờ để hấp thụ chất lỏng dư thừa, sau đó được trồng ngược qua đêm.

5 Lọc:

1). Xét nghiệm định kỳ: Các thuộc địa sẽ được tiêm 1-5 ml LB (chứa nồng độ cuối cùng là 100)mg/ml Ampicillium su) môi trường, 37 ℃ Shaker dao động nuôi cấy qua đêm, chiết xuất plasmid sau khi bảo quản các loài nấm, áp dụng PCR hoặc phương pháp cắt enzyme để xác định xem các mảnh chèn là chính xác.

2). Kiểm tra nhanh: Chọn các thuộc địa để kiểm tra PCR trực tiếp (xem bản sao phân tử 3 hoặc tham khảo hướng dẫn sử dụng bộ dụng cụ xác định PCR của các thuộc địa mang T CV05-Universal của công ty).
3). Giám định trình tự: Sử dụng bộ phận thử tự động dẫn hoặc dẫn dẫn khởi động T2 để xác định xem có nhân bản mục đích hay không.

Bộ dụng cụ này đi kèm với mồi giải trình tự (cũng được sử dụng cho mồi xác định PCR thuộc địa):

v Phụ lục:

ở Làm thế nào để tính toán số lượng sản phẩm PCR cần thiết trong phản ứng kết nối?

Nói chung, tỷ lệ mol của sản phẩm PCR và chất mang được tối ưu hóa đến 1: 1~10: 1 (khuyến nghị 3: 1) cho kết quả tốt, có thể sử dụng công thức sau:

[Lượng chất mang được thêm vào (ng) × Kích thước mảnh chèn (kb) ÷ Kích thước tàu sân bay (kb)] × Tỷ lệ mol của mảnh chèn và mảnh mang=Lượng mảnh chèn (ng) Ví dụ: Tỷ lệ mol của mảnh chèn và kết nối tàu sân bay là 3: 1, chẳng hạn như khi chất mang 40ng được thêm vào phản ứng kết nối và kích thước mảnh chèn là 500bp, tại thời điểm đó, lượng mảnh chèn nên được thêm vào là [chất mang 40ng × 0,5kb mảnh chèn ÷ 2,974kb tàu sân bay] × 3/1=20,2ng.

Zero Background Flat End Clone Kit Nguyên tắc T4