Một bước Seamless Cloning Kit

Bộ sao chép liền mạch một bước (mảnh (Single Fragment)

Một bước Seamless Cloning Kit

Số thư mục:42111

Khối lượng đóng gói:

Lưu trữ sản phẩm:-20°C. Bảo quản, tránh đông lạnh nhiều lần

Mô tả sản phẩm:Bộ dụng cụ nhân bản liền mạch một bước không phụ thuộc vào enzyme kết nối T4, không bị giới hạn bởi vị trí cắt enzyme của phần mang và mục đích, mà trực tiếp với phương pháp tái tổ hợp phần chồng chéo, sử dụng tổ hợp enzyme đặc biệt có thể kết nối lại định hướng của phần mang sau khi tuyến tính hóa phương pháp tùy ý và phần PCR với vùng chồng chéo 16-25bp ở cả hai đầu của nó, có thể đạt được trong vòng 30 phút A kết thúc hoặc phần sản phẩm PCR kết thúc phẳng được nhân bản liền mạch hiệu quả đến bất kỳ vị trí nào của phần mang.

Tính năng sản phẩm:

1. 30 phút có thể chèn một đoạn khuếch đại PCR 50bp-15kb (đầu phẳng/A) vào bất kỳ vị trí nào của bất kỳ tàu sân bay nào.

2. Không bị giới hạn bởi sự sẵn có của các vị trí cắt enzyme mang và chèn các đoạn và kết thúc hòa bình/kết thúc dính, có thể được nhân bản ở bất kỳ vị trí nào.

3. Nhân bản liền mạch, các điểm chèn không giới thiệu các chuỗi cơ sở không mong muốn.

4. Không phụ thuộc vào enzyme kết nối và phosphatase, hiệu quả cao, chính xác, tỷ lệ nhân bản dương tính có thể đạt trên 95%.

Sơ đồ nguyên tắc bộ dụng cụ nhân bản liền mạch một bước:

Chuẩn bị các vectơ tuyến tính và các mảnh DNA chèn:

A: Chuẩn bị tàu sân bay tuyến tính

(1). Nguồn enzym cắt: enzym cắt thu được chất mang tuyến tính, đầu phẳng hoặc đầu dính, đơn enzym cắt hoặc hai enzym cắt đều có thể, sau khi enzym cắt keo thu hồi.

Lưu ý: Không có chuỗi DNA ligase trong hệ thống phản ứng nhân bản liền mạch một bước, sẽ không xảy ra phản ứng tự kết nối vector. Do đó, ngay cả các vectơ tuyến tính được chuẩn bị theo phương pháp cắt đơn enzyme cũng không cần xử lý triệt để. Các bản sao dương tính giả (không có mảnh chèn) xuất hiện sau khi chuyển đổi sản phẩm tái tổ hợp được hình thành bởi sự chuyển đổi của các vectơ vòng hoàn toàn không tuyến tính của enzyme cắt không wa. Chúng tôi khuyên rằng việc thu hồi keo sau khi cắt enzyme có thể làm giảm tỷ lệ chất mang không tuyến tính này xuống mức thấp hơn.

(2). Nguồn PCR đảo ngược: Nên sử dụng DNA polymerase có độ trung thực cao để chuẩn bị, nếu dải khuếch đại đơn lẻ có thể thu được tàu sân bay bằng cách tinh chế sản phẩm PCR (số hàng: DC012-50), nếu không sẽ thu được tàu sân bay bằng cách thu hồi keo (số hàng: DC011-50).

Lưu ý: Mẫu plasmid của PCR đảo ngược cũng là một chất mang phi tuyến tính và cũng có thể dẫn đến nhân bản dương tính giả (không có mảnh chèn), do đó mẫu plasmid được tiêu hóa với enzyme nội tiếp Dpn I trước khi tinh chế chất mang tuyến tính nguồn PCR (sản phẩm PCR), có thể làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính. Nhưng nói chung, sau khi tái chế keo đã đủ để giảm tỷ lệ tàu sân bay không tuyến tính này xuống thấp hơn zui, vì vậy các tàu sân bay tuyến tính của nguồn PCR đảo ngược chúng tôi cũng khuyên bạn nên tái chế keo.

B: Chuẩn bị các mảnh DNA chèn

(1). Nguyên tắc chung của thiết kế mồi nhân bản liền mạch một bước là: bằng cách giới thiệu một trình tự đồng nhất đầu cuối của chất mang nhân bản tuyến tính ở đầu 5'của chất dẫn, làm cho các sản phẩm khuếch đại phân đoạn chèn 5'và cuối cùng 3' lần lượt có một trình tự hoàn toàn nhất quán (16 bp~20 bp) tương ứng với hai đầu của chất mang nhân bản tuyến tính.

(2). Thiết kế mồi phân đoạn chèn: Một mồi nhân bản bao gồm một chuỗi mồi cụ thể của đoạn chèn và một chuỗi chồng chéo.

Clone forward mồi (5'-3'): Linear vector forward 16-25 nt chồng chéo zone sequence (tính từ cuối 3')+Chèn đoạn forward-specified mồi sequence (18-25 nt)

Clone Reverse mồi (5'-3'): Linear Carrier Reverse 16-25 nt chồng chéo vùng trình tự (tính từ cuối 3')+Chèn đoạn ngược cụ thể mồi trình tự (18-25 nt)

Lưu ý: Các vùng chồng chéo có cơ sở kiềm ít nhất 16 bp và giá trị Tm giữa các vùng chồng chéo nhiều đoạn phải nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C), nếu không số lượng cơ sở có thể được kéo dài cho đến khi đáp ứng yêu cầu.

Theo cấu trúc của kết thúc mang tuyến tính (5'nhô ra, 3'nhô ra, kết thúc bằng phẳng), thiết kế mồi cũng được chia thành 3 trường hợp, được biểu thị như sau:

Cả hai đầu của tàu sân bay tuyến tính bởi vì các phương pháp tuyến tính (chẳng hạn như cắt đơn enzyme, cắt kép, PCR đảo ngược) khác nhau, có thể là bất kỳ sự kết hợp nào của hai hoặc hai cấu trúc cuối của ba loại trên. Nguyên tắc thiết kế mồi cụ thể của mảnh chèn tuân theo nguyên tắc thiết kế mồi chung là ok.

Khi tính toán nhiệt độ ủ mồi khuếch đại, chỉ cần tính giá trị Tm của trình tự khuếch đại đặc hiệu gen và trình tự tương đồng đầu cuối của vectơ không nên tham gia vào tính toán.

(3). Lựa chọn enzyme: Khuyến nghị sử dụng DNA polymerase có độ trung thực cao hoặc PCR Mix (P517-05 hoặc P814-05).

(4). Điều kiện phản ứng: thường được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng polymerase cụ thể.

(5). Phân đoạn chèn tinh khiết

l Tùy chọn: Nếu mảnh vỡ có nguồn gốc từ mẫu plasmid và plasmid này có sức đề kháng tương tự như chất mang tái tổ hợp, tiêu hóa mẫu plasmid với enzyme nội mô Dpn I trước khi tinh chế có thể làm giảm nền và tăng tỷ lệ dương tính.

l Nếu mảnh duy nhất, nó được khuyến khích để tinh chế mảnh với bộ dụng cụ tinh chế sản phẩm PCR (số DC012-100).

l Nếu có sự khuếch đại không đặc hiệu, nên sử dụng bộ dụng cụ thu hồi keo (DC011-100) để thu hồi các mảnh vỡ.

l Sử dụng phương pháp này để nhân bản, để tuyến tính hóa chất mang enzyme cắt vị trí sẽ bị thiếu khi nối, nếu có yêu cầu nghiêm ngặt về vị trí enzyme cắt, đề nghị chú ý đến sự lựa chọn của vị trí enzyme cắt, khi cần thiết có thểGiữa trình tự vùng chồng chéo và trình tự gen cụ thể của mồi nhân bản chuyển tiếp và ngượcTăng cơ sở bị thiếu để khôi phục vị trí cắt enzyme ban đầu (xem ví dụ sau).

l Nếu plasmid tái tổ hợp được sử dụng để biểu hiện protein, hãy chú ý đến khung đọc khi thiết kế mồi, và các trình tự cần thiết để biểu hiện và tinh chế protein (chẳng hạn như trình khởi chạy, trình tự RBS, codon bắt đầu, codon kết thúc, nhãn protein, v.v.) không bị phá hủy.

Ví dụ về thiết kế mồi chuyển tiếp (EcoR I enzyme):

Như hình trên, vectơ được cắt bởi enzyme Ecor I để tạo thành một đầu nhô ra 5':

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, bắt đầu từ đầu 3'và quay trở lại 16bp-25bp (ví dụ này sử dụng kết thúc 20 bp chồng chéo cùng một chuỗi), thêm vào phía trước của chuỗi mồi cụ thể của đoạn mục tiêu. Đảm bảo rằng các giá trị Tm của các vùng chồng chéo vẫn nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C).

Dẫn chuyển tiếp cụ thể như sau: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNhà hàng 3'

Lưu ý: Sau khi thiết kế mồi trên hoàn thành kết nối nhân bản, vết cắt enzyme EcoR I sẽ biến mất (không giữ lại vết cắt enzyme).

Nếu cần giữ lại vị trí cắt enzyme EcoR I, cần bổ sung trình tự vị trí nhận dạng EcoR I còn thiếu aattc giữa trình tự chồng chéo 20 bp ở cuối chất mang và trình tự mồi cụ thể của phân đoạn mục đích, và sau khi kết nối nhân bản được hoàn thành, vị trí cắt enzyme EcoR I vẫn còn (vị trí cắt enzyme được giữ lại).

Cụ thể như sau: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Ví dụ về thiết kế mồi ngược (Hind III enzyme cut):

Như hình trên, vectơ được cắt bởi enzyme Hind III để tạo thành một đầu nhô ra 5':

Theo các nguyên tắc thiết kế trên, bắt đầu từ đầu 3'và quay trở lại 16bp-25bp (ví dụ này sử dụng kết thúc 20 bp chồng chéo cùng một chuỗi), thêm vào phía trước của chuỗi mồi cụ thể của đoạn mục tiêu. Đảm bảo rằng các giá trị Tm của các vùng chồng chéo vẫn nhất quán và>60 ° C (AT pair=2 ° C và GC pair=4 ° C).

Đảo ngược mồi cụ thể như sau: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANhà hàng 3'

LƯU Ý: Sau khi thiết kế mồi trên hoàn thành kết nối nhân bản, tiếp tuyến Hind III sẽ biến mất (không giữ lại tiếp tuyến enzyme).

Nếu cần giữ lại vị trí cắt enzyme Hind III, trình tự vị trí nhận dạng Hind III còn thiếu agctt cần được bổ sung giữa trình tự chồng chéo 20 bp ở cuối vectơ và trình tự mồi cụ thể của phân đoạn đích, và vị trí cắt enzyme Hind III vẫn còn (vị trí cắt enzyme được giữ lại).

Cụ thể như sau: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAAgctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Các bước hoạt động của phản ứng clone liền mạch:

Lưu ý: 2 × OneStep Cloning Mix chứa chất tăng cường kết nối PEG rất dính, lấy ra khỏi tủ lạnh khi nhiệt độ thấp sẽ dính hơn, có thể đặt trong lòng bàn tay đông lạnh trong vài phút để tăng nhiệt độ có thể làm giảm độ dính (không ảnh hưởng đến chất lượng), trộn đều, ngay lập tức thu thập ly tâm đến đáy ống.

1. Thiết lập hệ thống phản ứng theo bảng dưới đây (có thể sử dụng ống PCR để điều chế ở nhiệt độ phòng)

* Tàu sân bay thường sử dụng 20-50 ng, tỷ lệ mol của mảnh chèn và tàu sân bay là tốt nhất giữa 2: 1-3: 1; Nếu đoạn chèn nhỏ hơn 200bp, tỷ lệ mol của đoạn chèn với vectơ là 5: 1.

2. Nhẹ nhàng trộn đều, ở 50.°Phản ứng C trong 15 phút (có thể được thực hiện trên thiết bị PCR), sau khi kết thúc phản ứng, ống PCR được chuyển đổi trực tiếp hoặc lưu trữ ở -20°C. Các đoạn ngắn hơn, chẳng hạn như 100bp-1kb, chỉ mất 15 phút để có đủ bộ chuyển đổi, và các đoạn dài hơn có thể kéo dài thời gian phản ứng lên đến 60 phút.

3. 5 μl sản phẩm phản ứng được lấy để chuyển đổi theo hướng dẫn của tế bào trạng thái cảm nhận (nếu có ít transistor hơn, tất cả các sản phẩm có thể được chuyển đổi và tất cả các tấm phủ dịch chuyển đổi có thể được chuyển đổi).

Xác định nhân bản dương tính:

Có thể căn cứ vào tình huống cụ thể, lựa chọn xác định PCR thuộc địa, chiết xuất plasmid (số 31013-100) để tiến hành xác định enzyme nội bào hạn chế hoặc xác định trình tự.

Một bước Seamless Cloning Kit