Thí nghiệm Pull down: Pull down

I. Giới thiệu công nghệ

Thí nghiệm Pull-downCòn gọi là thí nghiệm kéo xuống, là một loại kỹ thuật thuần hóa thân thiện bên ngoài cơ thể.

II. Nguyên tắc kỹ thuật

Cố định một protein trên một ma trận nhất định (chẳng hạn nhưSepharose), nhưng khi chất chiết xuất tế bào đi qua ma trận này, các protein phối tử có thể tương tác với protein cố định này được hấp thụ, trong khi "tạp chất" không bị hấp thụ chảy ra với chất tẩy rửa. Protein hấp thụ có thể được thu hồi bằng cách thay đổi điều kiện tẩy rửa hoặc tẩy rửa.

III. Cảnh ứng dụng

Xác minh tương tác protein đã biết: Bằng cách thực hiện thí nghiệm Pull-down với protein mồi đã biết có thể tương tác, mối quan hệ tương tác giữa chúng có thể được xác minh nếu sự hiện diện của protein mồi được phát hiện.

2. Sàng lọc tương tác protein không xác định: Các protein mồi được sàng lọc để tương tác với protein mồi bằng cách thực hiện thí nghiệm Pull-down với chất lỏng lysis tế bào hoặc hỗn hợp protein khác, sau đó các protein liên kết được xác định.

3. Nghiên cứu thành phần phức hợp protein: phức hợp protein được phân lập bằng thí nghiệm Pull-down, sau đó protein trong phức hợp được xác định, thành phần cấu thành của phức hợp protein có thể được xác định.

4. Nghiên cứu tương tác giữa protein và axit nucleic: Sử dụng DNA Pull-down và công nghệ RNA Pull-down, tương tác giữa protein và DNA, RNA có thể được nghiên cứu, chẳng hạn như liên kết yếu tố phiên mã với promoter, liên kết protein gắn RNA với RNA, v.v.

IV. Lợi thế kỹ thuật

Có thể xác định xem protein đích và protein thử nghiệm có thể tương tác trực tiếp hay không.

V. Loại mẫu

Tế bào tươi (tế bào dán tường/tế bào lơ lửng), tế bào đông lạnh, mô đông lạnh, mẫu dịch lysis.

VI. Yêu cầu mẫu

Mẫu tế bào: khoảng 5 × 10 ^ 6 (có thể là 2 đĩa 6cm, hoặc được lưu trữ trong ống ly tâm ở dạng tế bào lơ lửng, hoặc 2 chai T25);

Mô đông lạnh: khoảng 40 mg;

Mẫu chất lỏng lysis: nồng độ protein không dưới 2mg/mg và tổng lượng protein không dưới 3mg.

VII. Chuẩn bị mẫu&Vận chuyển

Mẫu tế bào sống: khoảng cách gần hơn có thể cung cấp mẫu tươi, sẽ nuôi cấy trong đĩa/chai T25/ống ly tâm bên trong mẫu tế bào tươi ở nhiệt độ bình thường chuyển phát nhanh (muộn nhất là ngày hôm sau), trong thành phố có thể flash hoặc giao hàng trực tiếp, khoảng cách xa hơn, có thể -80 ℃ băng khô tế bào đông lạnh vận chuyển;

Mẫu mô&mẫu chất lỏng lysis: -80 ℃ Băng khô đông lạnh vận chuyển.

8.Thuốc thử cần cung cấp

Nếu tiến hành kiểm tra WB, cần cung cấp kháng thể tương ứng.

IX. Chu kỳ thử nghiệm

3-4 tuần (không bao gồm khối phổ)

X. Khác

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， Thông báo cụ thể về các loại protein và protein mục tiêu, sau đó kiểm tra Western blot/phổ protein, chi phí biểu hiện protein tổng hợp trong ống nghiệm được tính toán dựa trên đánh giá protein mục tiêu cụ thể.

Yếu tố phiên mã, một phần thí nghiệm cũng có thể sử dụng protein biểu hiện tái tổ hợp.

VI. Yêu cầu mẫu

Mẫu tế bào: khoảng 1 × 10 ^ 7 (có thể là 1 đĩa 10cm, hoặc được lưu trữ trong ống ly tâm ở dạng tế bào lơ lửng, hoặc 1 chai T75);

Mô đông lạnh: khoảng 400 mg;

Mô thực vật: khoảng 2g; cytonuclein, yếu tố phiên mã tinh khiết, protein biểu hiện tái tổ hợp, vv: mỗi màng cung cấp ít nhất 50ul ở nồng độ không dưới 0,5mg/ml.

VII. Chuẩn bị mẫu&Vận chuyển

Các mẫu tế bào sống: khoảng cách gần hơn có thể được vận chuyển trong đĩa/chai T75/ống ly tâm của các mẫu tế bào tươi ở nhiệt độ bình thường (muộn nhất là ngày hôm sau), trong thành phố có thể được vận chuyển bằng đèn flash hoặc trực tiếp, khoảng cách xa hơn, có thể được vận chuyển bằng băng khô tế bào đông lạnh -80 ℃;

Mẫu mô&mẫu chất lỏng khác: -80 ℃ Băng khô đông lạnh vận chuyển.

8.Thuốc thử cần cung cấp

Kháng thể đặc hiệu liên kết protein trên 50ul ở nồng độ lớn hơn 0,5 mg/ml.

IX. Chu kỳ thử nghiệm

2-3 tuần

X. Khác

Trình tự thăm dò, chẳng hạn như trình tự không thăm dò, cung cấp thông tin liên quan đến protein gắn DNA hoặc tài liệu liên quan.