Thí nghiệm tương tác phân tử: CLIP UV kết tủa miễn dịch

I. Giới thiệu công nghệ

CLIP (Cross-linking immunoprecipitation) là 交联Miễn dịch đồng kết tủa(Bằng cách kết hợpLiên kết chéo UVVà phương pháp cộng kết miễn dịch để phân tích vị trí gắn kết của protein với RNA.

II. Nguyên tắc kỹ thuật

Kỹ thuật CLIP sử dụng bức xạ cực tím để liên kết chéo cộng hóa trị giữa RNA trong tế bào và protein gắn RNA (RBP), sau đó làm giàu các đoạn RNA liên kết với RBP cụ thể bằng phương pháp kết tủa miễn dịch, sau đó thông qua các bước như phiên mã ngược và giải trình tự thông lượng cao để thu được thông tin về vị trí gắn kết RNA và trình tự liên kết của RBP trong cơ thể.

III. Cảnh ứng dụng

1. Nghiên cứu tương tác protein-RNA: Xác định vị trí liên kết RNA và trình tự liên kết của một protein cụ thể trong cơ thể, tiết lộ cơ chế hoạt động của protein trong điều hòa sau phiên mã.

2. Nghiên cứu liên quan đến bệnh: Các sự kiện liên quan đến RNA và mạng lưới quy định liên quan đến sự xuất hiện, phát triển của bệnh được phát hiện bằng cách so sánh các liên kết RNA của RBP ở trạng thái bình thường và bệnh tật.

3. Nghiên cứu và phát triển dược phẩm: Cung cấp các mục tiêu và cơ chế hoạt động mới cho nghiên cứu và phát triển dược phẩm, giúp phát triển các loại thuốc nhắm vào các protein gắn RNA cụ thể hoặc các phân tử RNA mà chúng điều chỉnh.

4. Phân tích tin sinh học: Thông qua phân tích tin sinh học của dữ liệu CLIP-seq, dự đoán vị trí liên kết và mô hình liên kết của protein gắn RNA, xây dựng mạng điều chỉnh RNA, v.v.

IV. Lợi thế kỹ thuật

1. Phát hiện tại chỗ trong cơ thể: Có thể nắm bắt sự tương tác giữa protein và RNA trong các tế bào sống, phản ánh thực tế trạng thái sinh lý của cơ thể.

2. Độ đặc hiệu cao hơn và độ tinh khiết nghiêm ngặt: Việc tinh chế phức hợp liên kết chéo bằng kháng thể hoặc nhãn cụ thể có thể loại bỏ hiệu quả RNA và protein không liên kết cụ thể và tăng độ tin cậy của kết quả.

3. Kết hợp giải trình tự thông lượng cao: Kết hợp với công nghệ giải trình tự thông lượng cao, vị trí liên kết RNA và trình tự liên kết của RBP có thể được xác định trong toàn bộ phạm vi bộ gen để có được thông tin phong phú.

V. Loại mẫu

Tế bào tươi (tế bào dán tường/tế bào lơ lửng), mẫu tế bào sau liên kết chéo UV.

VI. Yêu cầu mẫu

Mẫu tế bào: khoảng 1 × 10 ^ 7 (có thể là 1 đĩa 10cm, hoặc được lưu trữ trong ống ly tâm ở dạng tế bào lơ lửng, hoặc 1 chai T75);

Mẫu tế bào liên kết chéo: 254 nm, 150 mJ/cm² tế bào xử lý liên kết chéo UV tiêu chuẩn.

VII. Chuẩn bị mẫu&Vận chuyển

Các mẫu tế bào sống: gần hơn có thể được vận chuyển trong đĩa/chai T75/ống ly tâm của các mẫu tế bào tươi ở nhiệt độ bình thường (muộn nhất là ngày hôm sau), có thể được giao trong thành phố bằng đèn flash hoặc trực tiếp;

Mẫu tế bào sau liên kết chéo: -80 ℃ Vận chuyển băng khô đông lạnh.

8.Thuốc thử cần cung cấp

Xét nghiệm kháng thể cấp ChIP.

IX. Chu kỳ thử nghiệm

1-2 tuần (không bao gồm giải trình tự)

X. Khác

Phát hiện tiếp theo Khi chọn RT PCR, bạn cần cung cấp vị trí để phát hiện tiếp theo.