Thí nghiệm tương tác phân tử: RIP (RNA miễn dịch kết tủa)

I. Giới thiệu công nghệ

Kỹ thuật RIP (RNA Immunoprecipitation) là một phương pháp thử nghiệm quan trọng được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác giữa RNA và protein trong tế bào, có thể tiết lộ cơ chế chức năng của protein gắn RNA (RBP) trong điều hòa sau phiên mã.

II. Nguyên tắc kỹ thuật

RIP sử dụng kháng thể nhắm vào protein mục tiêu để kết tủa phức hợp RNA-protein tương ứng xuống, thông qua tách và tinh chế, tiến hành xác minh RT-PCR hoặc phân tích trình tự RNA liên kết với phức hợp, kết quả càng có sức thuyết phục về mặt sinh học.

III. Cảnh ứng dụng

Cơ chế cơ bản: Phân tích chức năng của các protein gắn RNA (ví dụ: AGO2, Polycomb Complex) và mạng điều khiển RNA.

Nghiên cứu bệnh: So sánh sự khác biệt giữa RNA-protein trong các mẫu bình thường của bệnh và các dấu ấn sinh học tiềm ẩn (ví dụ: lncRNA liên quan đến ung thư) được tìm thấy.

3. Phát triển thuốc: Đánh giá tác dụng của thuốc đối với sự tương tác RNA-protein và tăng tốc độ sàng lọc mục tiêu.

IV. Lợi thế kỹ thuật

1. Độ nhạy cao hơn: có thể phát hiện sự tương tác yếu giữa RNA và protein có độ phong phú thấp.

Phạm vi động rộng: áp dụng từ một số lượng nhỏ các tế bào (chẳng hạn như 5 × 10 ⁷) đến các mẫu mô phức tạp.

Sử dụng đa nhóm: Kết hợp RNA-Seq, CLIP-Seq hoặc ChIP-Seq để xây dựng mạng điều tiết đa chiều.

V. Loại mẫu

Tế bào tươi (tế bào dán tường/tế bào lơ lửng), tế bào đông lạnh, mô đông lạnh, mẫu tế bào sau liên kết chéo.

VI. Yêu cầu mẫu

Mẫu tế bào: khoảng 1 × 10 ^ 7 (có thể là 1 đĩa 10cm, hoặc được lưu trữ trong ống ly tâm ở dạng tế bào lơ lửng, hoặc 1 chai T75);

Mô đông lạnh: khoảng 70 mg; mẫu tế bào liên kết chéo: các tế bào được xử lý bằng cách sử dụng liên kết chéo formaldehyde 1%.

VII. Chuẩn bị mẫu&Vận chuyển

Các mẫu tế bào sống: khoảng cách gần hơn có thể được vận chuyển trong đĩa/chai T75/ống ly tâm của các mẫu tế bào tươi ở nhiệt độ bình thường (muộn nhất là ngày hôm sau), trong thành phố có thể được vận chuyển bằng đèn flash hoặc trực tiếp, khoảng cách xa hơn, có thể được vận chuyển bằng băng khô tế bào đông lạnh -80 ℃;

Mẫu mô&mẫu tế bào sau liên kết chéo: -80 ℃ Vận chuyển băng khô đông lạnh.

8.Thuốc thử cần cung cấp

Xét nghiệm kháng thể cấp ChIP.

IX. Chu kỳ thử nghiệm

1-2 tuần (không bao gồm giải trình tự)

X. Khác

Phát hiện tiếp theo Khi chọn RT PCR, bạn cần cung cấp vị trí để phát hiện tiếp theo.

Các bước cụ thể của tế bào liên kết chéo formaldehyde: thêm nồng độ formaldehyde cuối cùng là 1% vào đĩa tế bào, ủ ở 37 ° C trong 10 phút; ② Rửa tế bào hai lần bằng DPBS lạnh có chứa [1mM PMSF, 1μg/ml ức chế peptidase và 1μg/ml pepstatin A]. ③ Các tế bào được cạo vào 2ml DPBS lạnh có chứa chất ức chế protease và chuyển vào ống ly tâm để gửi đông lạnh.