Thí nghiệm phân tử: CUT& Tag mục tiêu cắt và dán nhãn

I. Giới thiệu công nghệ

CUT&TAG là một kỹ thuật phân tích biểu sinh có độ nhạy cao dựa trên sự hướng dẫn kháng thể để cắt nhiễm sắc thể nhắm mục tiêu và dán nhãn, vượt qua các nút thắt cổ chai như độ nhạy thấp, tiếng ồn nền cao, nhu cầu mẫu lớn của ChIP-seq truyền thống, có thể phân tích các đặc điểm nhiễm sắc thể như sửa đổi histone, liên kết yếu tố phiên mã và các đặc điểm khác ở cấp độ tế bào đơn để trở thành nghiên cứu biểu sinh mớiphương hướng。

II. Nguyên tắc kỹ thuật

CUT&TAG cho phép phân tích chromatin chính xác thông qua bốn phản ứng chính:

1. Định vị mục tiêu kháng thể:Một kháng thể đặc hiệu (ví dụ như kháng thể H3K4me3) liên kết với vùng nhiễm sắc thể mục tiêu, Protein A/G lưỡng kháng mang phức hợp enzyme chuyển vị Tn5 (bao gồm khớp nối trình tự).

2. Mục tiêu cắt và dán nhãn:Enzyme chuyển vị Tn5, dưới sự hướng dẫn của kháng thể, tiến hành cắt sợi kép DNA của nhiễm sắc thể mục tiêu và kết nối với khớp, phạm vi cắt: khoảng 50-300 bp mỗi bên của vị trí mục tiêu.

3. Giải phóng đoạn DNA:Protease K tiêu hóa liên kết chéo chromatin, giải phóng các đoạn DNA có khớp.

4. Xây dựng và giải trình tự thư viện:PCR khuếch đại các đoạn mục tiêu, xây dựng thư viện giải trình tự Illumina với độ sâu giải trình tự:~20 triệu reads/sample (giảm 50% so với ChIP-seq).

III. Cảnh ứng dụng

CUT&TAG tiết lộ sự khác biệt biểu sinh của các nhóm phụ khác nhau trong vi môi trường khối u ở cấp độ đơn bào.

ví dụ

1. Ung thư vú ba âm tính: Các siêu tăng cường được điều chỉnh bởi FOXA1 được tìm thấy thông qua CUT&TAG đơn bào được kích hoạt cụ thể trong các phân nhóm giống cơ bản thúc đẩy biểu hiện của EMT (chuyển đổi biểu mô-kẽ) gen quan trọng như SNAI1, thúc đẩy di căn.

2. Bệnh bạch cầu tủy cấp tính: Theo dõi các mẫu tủy xương của bệnh nhân tái phát và xác định những thay đổi năng động trong sửa đổi H3K4me1 trong tế bào gốc CD34+báo trước sự phát triển của kháng hóa trị, cung cấp mục tiêu mới cho liệu pháp nhắm mục tiêu biểu kiến.

3. Lập trình lại biểu hiện phát triển phôi: CUT&TAG theo dõi quá trình xây dựng động lực của các sửa đổi histone trong sự phát triển phôi sớm.

Phôi tiền động mạch chuột: H3K9me3 được tìm thấy bắt đầu lắng đọng ở giai đoạn 2-cell, ưu tiên đánh dấu các vùng transposon phiên mã ngược (ví dụ: LINE-1) và sửa đổi này duy trì sự ổn định của bộ gen bằng cách ức chế hoạt động transposon.

5. Tế bào gốc phôi người: Lập bản đồ động của H3K27ac trong sự khác biệt thần kinh, xác định vị trí mạng lưới các chất tăng cường được quy định bởi SOX2 và OCT4, tiết lộ khả năng thoát khỏi các nút quan trọng.

6. Điều hòa chức năng tế bào miễn dịch: Phân tích cơ sở biểu kiến của sự khác biệt tế bào T và trạng thái chức năng.

7. Suy giảm tế bào T: Trong các mô hình nhiễm virus mãn tính, H3K27ac của các tế bào T CD8+suy giảm được tìm thấy là làm giàu bất thường locus PD-1 và TIM-3, và các hoạt động tăng cường này được điều chỉnh trực tiếp bởi các yếu tố phiên mã TOX.

8. Tế bào T điều hòa (Treg): Kết hợp ATAC-seq cho thấy FOXP3 ổn định chức năng ức chế của tế bào Treg bằng cách định hình lại sửa đổi H3K4me3, một quá trình dựa trên sự ức chế phối hợp H3K27me3 qua trung gian EZH2.

IV. Lợi thế kỹ thuật

1. Độ nhạy cao hơn (phát hiện cấp độ tế bào 100): enzyme chuyển vị Tn5 cắt trực tiếp tại vị trí mục tiêu và kết nối các khớp giải trình tự, tránh mất mát ngẫu nhiên do phân mảnh DNA (siêu âm phân mảnh) trong ChIP seq. CUT&TAG có tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn cao hơn 8 lần so với ChIP-seq (S/N=12: 1 so với 1,5: 1) và số lượng đỉnh khác biệt được phát hiện tăng 40%.

Độ phân giải cơ sở đơn và vị trí chính xác: Phức hợp kháng thể-Tn5 chỉ cắt DNA (± 50 bp) gần vị trí liên kết, trong khi phân mảnh siêu âm ChIP-seq tạo ra các mảnh ngẫu nhiên 200-500 bp. Trong phân tích vị trí liên kết p53, CUT&TAG phát hiện một đỉnh hẹp duy nhất (chiều rộng đỉnh ≈30 bp), trong khi ChIP-seq thể hiện một đỉnh rộng (chiều rộng đỉnh ≈200 bp), có thể được xác định chính xác đến trung tâm cơ sở TTGCCT.

3. Khả năng tương thích đơn bào với biểu sinh không gian: Kết hợp nền tảng Genomics 10x, bao bọc các tế bào riêng lẻ với phức hợp kháng thể-Tn5 trong các giọt dầu thông qua microfluiding, đã đạt được xây dựng biểu đồ đơn bào H3K27ac (Phương pháp tự nhiên, 2022).

Công nghệ Spatial CUT&Tag mới được phát triển có thể xác định vị trí phân bố cấu trúc phụ của H3K4me3 trên các lát mô, chẳng hạn như hình dung các sửa đổi liên quan đến hoạt động của tế bào thần kinh vùng hippocampus trong các lát não chuột.

V. Loại mẫu

Tế bào tươi (tế bào dán tường/tế bào lơ lửng), tế bào đông lạnh, mô đông lạnh.

VI. Yêu cầu mẫu

Mẫu tế bào: khoảng 10.000 (có thể là 1 lỗ trong một tấm 24 lỗ hoặc được lưu trữ trong ống ly tâm dưới dạng tế bào lơ lửng);

Mô đông lạnh: khoảng 10-20mg.

VII. Chuẩn bị mẫu&Vận chuyển

Mẫu tế bào sống: gần hơn có thể cung cấp mẫu tươi, mẫu tế bào tươi cấy trong đĩa/ống ly tâm được vận chuyển bằng chuyển phát nhanh nhiệt độ bình thường (đến muộn nhất vào ngày hôm sau), có thể được gửi bằng đèn flash hoặc trực tiếp trong thành phố; Khoảng cách xa hơn, có thể vận chuyển băng khô tế bào đông lạnh -80 ℃;

Mẫu mô: -80 ℃ Băng khô đông lạnh vận chuyển.

8.Thuốc thử cần cung cấp

Kháng thể cấp ChIP (nếu không có thì có thể chọn kháng thể cấp IF)

IX. Chu kỳ thử nghiệm

1-2 tuần (không bao gồm giải trình tự)

X. Khác

Phát hiện theo dõi Rrealtime PCR/Giải trình tự