Bộ sao chép nhanh một bước

Điều kiện lưu trữ và vận chuyển:-20℃

Thành phần sản phẩm:Bộ sao chép nhanh một bước

Giới thiệu sản phẩm

Bộ sao chép nhanh một bước

Dựa trên nguyên tắc tái tổ hợp của công nghệ nhân bản liền mạch, như một thế hệ mới của phương pháp nhân bản, không phụ thuộc vào cắt enzyme rườm rà, các bước kết nối, cũng không cần thiết phải bổ sung đầu cuối hoạt động bình đẳng, dựa trên sự tái tổ hợp của đoạn DNA và 15~25 nt trình tự cùng nguồn ở cuối chất mang tuyến tính, đoạn chèn có thể được nhân bản đến bất kỳ vị trí nào của chất mang tuyến tính, nền tự kết nối của chất mang là rất thấp, là một công nghệ nhân bản định hướng DNA đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả.

Bộ sao chép nhanh một bướcBộ dụng cụ nhân bản liền mạch cho phép tái tổ hợp một hoặc nhiều mảnh DNA trong một phản ứng duy nhất, nhanh nhất chỉ trong 5 phút và tỷ lệ dương tính cao hơn 95%. Các yếu tố phụ được thêm vào Kit, cải thiện hiệu quả tỷ lệ nhân bản dương tính; Một hệ thống phản ứng được tối ưu hóa có khả năng chịu được một số tạp chất có trong các sản phẩm PCR chưa tinh chế. Phiên bản nâng cấp của bộ dụng cụ nhân bản liền mạch có tỷ lệ dương tính cao hơn, khả năng tương thích tốt hơn.

Các bước thử nghiệm

1. Tóm tắt quy trình thử nghiệm

2. Chuẩn bị tàu sân bay nhân bản tuyến tính

Vị trí nhân bản thích hợp được chọn để tuyến tính hóa vectơ, có thể được thực hiện bằng cách cắt enzyme hoặc khuếch đại PCR ngược.

① Chuẩn bị cắt enzyme

Một số enzyme hạn chế không thể tiêu hóa DNA siêu xoắn một cách hiệu quả và do đó có thể để lại một lượng DNA vận chuyển khác nhau, làm giảm tỷ lệ dương tính. LightNingTM Fast Enzyme Enzyme Cut (đơn enzyme hoặc lưỡng enzyme) được khuyến cáo để tuyến tính hóa vectơ để giảm nền chuyển đổi (nhân bản dương tính giả thu được từ chuyển đổi vectơ không cắt).

CHÚ THÍCH 1: Các tàu sân bay được tuyến tính hóa bằng cách cắt enzyme không cần phải khử phosphoryl hóa, nên sử dụng cắt bisenzyme.

CHÚ THÍCH 2: Sau khi cắt enzyme hoàn tất, endolase được khuyến cáo sử dụng trong các phản ứng tái tổ hợp sau khi khử hoạt tính hoặc tinh chế các sản phẩm mục đích.

② Chuẩn bị mở rộng PCR ngược

Để giảm sự ra đời của đột biến khuếch đại, bạn nên sử dụng High Fidelity PCR Mix để khuếch đại. Việc sử dụng plasmid tiền tuyến tính làm mẫu được khuyến cáo để giảm ảnh hưởng của dư lượng plasmid vòng đối với tỷ lệ dương tính nhân bản.

CHÚ THÍCH 1: Khi sản phẩm PCR không có dải đặc hiệu, nên sử dụng mẫu plasmid tiêu hóa Template Eliminator (EG21203) cho phản ứng tái tổ hợp; Thay vào đó, nên sử dụng sản phẩm PCR sau khi tinh chế.

CHÚ THÍCH 2: Khi nhân bản nhiều mảnh, nên sử dụng sau khi tinh chế sản phẩm PCR.

3. Chèn mảnh PCR mồi thiết kế

Đầu 5'của mồi PCR phải chứa một chuỗi 15~25 nt (18 nt được khuyến nghị) cùng nguồn với đầu của đoạn liền kề (đoạn chèn hoặc tàu sân bay). Nếu tàu sân bay là một kết thúc dính và 3'kết thúc nhô ra, thiết kế mồi phải bao gồm một phần nhô ra; Nếu đầu 5 'nổi bật, thiết kế dẫn có thể bao gồm các phần nổi bật hoặc không.

Chèn đoạn trích khuếch đại chuyển tiếp mồi:

5'Trình tự tương đồng đầu cuối vector ngược dòng+vị trí cắt enzyme (tùy chọn)+Trình tự khuếch đại chuyển tiếp đặc hiệu gen 3'

Chèn đoạn trích khuếch đại ngược:

3'Trình tự khuếch đại ngược đặc hiệu di truyền+Vị trí cắt enzyme (tùy chọn)+Trình tự tương đồng cuối cùng của tàu sân bay hạ lưu 5'

Lưu ý 1: Cố gắng chọn khu vực không có trình tự lặp lại và hàm lượng GC đồng đều để nhân bản, khi hàm lượng GC trong khu vực 25 nt trên và dưới của vị trí nhân bản tàu sân bay là 40%~60%, tổ chức lại cao;

CHÚ THÍCH 2: Trình tự kết nối đầu cuối của chất mang PUC 19 (Ampr) được cung cấp bởi bộ dụng cụ này như sau:

4. khuếch đại PCR của mảnh chèn

Độ trung thực cao PCR Mix được khuyến cáo để giảm sự ra đời của đột biến khuếch đại. Phản ứng nhân bản liền mạch được khuyến nghị sử dụng sản phẩm PCR tinh khiết, nếu sản phẩm PCR được xác định là sản phẩm khuếch đại cụ thể bằng điện di gel agarose, nó có thể được sử dụng trực tiếp, nhưng khối lượng mẫu không được vượt quá 20% tổng khối lượng phản ứng.

5. Phản ứng tái cấu trúc

a) Cấu hình hệ thống phản ứng sau đây trong bồn tắm nước đá:

a. Liều lượng vận chuyển tối ưu (ng)=0,02 × logarit cơ sở vận chuyển, tức là 0,03 pmol.

b. Chèn một mảnh duy nhất, liều lượng mảnh phù hợp nhất (ng)=0,04 × logarit cơ bản của mảnh; Chèn nhiều mảnh, áp dụng cho mỗi mảnh zui (ng)=0,02 × logarit cơ bản của mảnh.

CHÚ THÍCH 1: Nếu chiều dài của một mảnh chèn lớn hơn chất mang, thì lượng chất mang và mảnh chèn nên được hoán đổi cho nhau;

CHÚ THÍCH 2: Nếu chiều dài của đoạn chèn nhỏ hơn 200 bp, đoạn chèn phải sử dụng 5 lần liều vận chuyển;

CHÚ THÍCH 3: Nếu sử dụng nhiều hơn so với công thức trênGiá trị cao nhất, thì đề nghị nhấn trực tiếpZui• Sử dụng với số lượng cao nhất;

CHÚ THÍCH 4: Tỷ lệ nhân bản dương tính đều giảm khi các đoạn vectơ quá dài, các đoạn chèn quá dài hoặc số lượng đoạn quá nhiều.

Sau khi hoàn thành phối chế hệ thống phản ứng tổ hợp lại, dùng súng di dịch nhẹ nhàng hút trộn đều các thành phần, tránh sinh ra bong bóng khí, chớ xoáy.

② Đặt hệ thống phản ứng ở 50 ℃, phản ứng 5~60 phút.

Lưu ý 1: Đề nghị sử dụng máy đo PCR và các dụng cụ kiểm soát nhiệt độ tương đối chính xác để phản ứng, thời gian phản ứng không đủ hoặc hiệu quả nhân bản quá dài sẽ giảm;

Lưu ý 2: Khi chèn 1~2 mảnh, thời gian phản ứng được đề nghị là 5~15 phút; Khi chèn 3~5 mảnh, thời gian phản ứng được đề nghị là 15~30 phút;

Lưu ý 3: Khi khung vận chuyển trên 10 kb hoặc mảnh chèn trên 4 kb, nên kéo dài thời gian phản ứng đến 30~60 phút;

Lưu ý 4: Sau khi hoàn thành phản ứng 50 ℃, nên tiến hành ly tâm tức thời, thu thập chất lỏng phản ứng xuống đáy ống.

③ Đặt ống ly tâm chất lỏng phản ứng trên băng để làm mát, sau đó chuyển đổi hoặc lưu trữ ở -20 ℃.

Lưu ý 1: -20 ℃ sản phẩm tái tổ hợp được lưu trữ, được khuyến khích sử dụng trong vòng 1 tuần.

6. Chuyển đổi sản phẩm tái cấu trúc

Lấy 5-10μl chất lỏng phản ứng, thêm vào 100μl tế bào trạng thái cảm nhận, từ từ hút và trộn đều, đặt trên băng 30 phút. Nhiệt độ 42 ℃ 45~60 sec, tắm đá 5 phút. Thêm 500 μl môi trường SOC hoặc LB, dao động 37 ℃ 40~60 phút (200 vòng/phút). Bôi đều dịch vi khuẩn lên máy tính bảng có chứa kháng sinh tương ứng, đảo ngược ở 37 độ C qua đêm nuôi cấy.

Lưu ý 1: Tỷ lệ nhân bản dương tính cuối cùng của các tế bào cảm thụ khác nhau sẽ khác nhau, nên sử dụng tế bào cảm thụ có hiệu suất chuyển đổi>108 CFU/μg;

CHÚ THÍCH 2: Số lượng khuẩn lạc phụ thuộc vào số lượng và độ tinh khiết của sản phẩm PCR so với chất mang tuyến tính;

Lưu ý 3: Máy tính bảng đối chứng dương tính thường phát triển một số lượng lớn các thuộc địa đơn màu trắng và máy tính bảng đối chứng âm tính chỉ phát triển một số ít.

7. Kiểm tra nhân bản dương tính

Các thuộc địa đơn lẻ được chọn và trộn đều trong 10 μl ddH2O, sau khi tách 95 ℃ trong 10 phút, 1 μl lysis được lấy làm khuôn mẫu để xác định PCR thuộc địa, hoặc sau khi cấy các thuộc địa đơn lẻ vào môi trường kháng qua đêm, plasmid được chiết xuất để xác định cắt enzyme.

Xét nghiệm nhân bản dương tính đối chứng, PCR thuộc địa sử dụng các mồi chung M13F và M13R và HindIII và EcoRI để xác định cắt enzyme.

CHÚ THÍCH 1: Khi PCR thuộc địa được khuyến cáo sử dụng ít nhất một mồi chung để tránh kết quả dương tính giả;

CHÚ THÍCH 2: Các kết quả dương tính có thể được xác định thêm nếu cần thiết.

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

Được thành lập vào năm 2004, công ty Azaood của Mỹ là một lingdao công nghiệp phát triển và sản xuất enzyme tinh khiết chất lượng cao, protein, axit nucleic và bộ tách tế bào, huyết thanh bò thai cho nghiên cứu khoa học đời sống, chẩn đoán và ứng dụng công nghệ sinh học; Công ty Azuod là nhà sản xuất chính được chứng nhận ISO9001, có thể đáp ứng các yêu cầu và ứng dụng từ nghiên cứu đến xử lý sinh học hàng loạt quy mô lớn và OEM.