Tóm tắt

Protein VP2 của virus lở mồm long móng là kháng nguyên cấu trúc quan trọng và phân tích kháng nguyên của các sản phẩm biểu hiện prokaryote của nó là rất quan trọng để phát triển vắc-xin mới. Nghiên cứu đã xây dựng một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao bằng cách sử dụng máy đục lỗ điện Venid Mini Pulse 399 tiết kiệm để đạt được biểu hiện hòa tan của protein VP2 bằng cách tối ưu hóa điều kiện chuyển đổi E. coli BL21 (DE3). Được ELISA và Western blot xác nhận, hoạt động gắn kết đặc hiệu của sản phẩm với kháng thể LMV đạt 89% protein tự nhiên, cung cấp hỗ trợ kỹ thuật cho sản xuất nguyên liệu vắc-xin chi phí thấp.

Giới thiệu

Bệnh lở mồm long móng (FMD), một bệnh truyền nhiễm mạnh gây hại cho ngành chăn nuôi, protein cấu trúc VP2, tác nhân gây bệnh của nó, virus lở mồm long móng (FMDV), tham gia vào việc lắp ráp capsid virus và là chất mang kháng nguyên quan trọng gây ra vật chủ sản xuất kháng thể trung hòa. Do hoạt động dễ dàng và chi phí thấp, hệ thống biểu hiện prokaryote đã trở thành nền tảng để sản xuất protein kháng nguyên VP2 theo quy mô. Tuy nhiên, protein VP2 giàu cấu trúc gấp beta, dễ hình thành các chất bao phủ trong E. coli và các vấn đề như hiệu quả thấp và tổn thương tế bào nghiêm trọng với các phương pháp chuyển đổi truyền thống, dẫn đến sản xuất protein hòa tan không đủ và cấu hình kháng nguyên bị suy giảm, hạn chế ứng dụng của nó trong phát triển vắc-xin.

Kỹ thuật thủng điện làm thay đổi tính thấm của màng tế bào ngay lập tức thông qua điện trường xung và là phương tiện trung tâm để phân phối gen ngoại sinh của các tế bào nhân sơ. Máy đục lỗ điện kinh tế Venid Mini Pulse 399 đã vượt qua giới hạn thiết bị truyền thống, sử dụng công nghệ xung sóng chỉ số chính xác cao và hệ thống giám sát hồ quang thời gian thực để cải thiện đáng kể hiệu quả chuyển đổi trong khi đảm bảo tỷ lệ sống sót cao của tế bào. Giao diện hoạt động tối giản của nó chỉ cần thiết lập các thông số điện áp có thể được kích hoạt bằng một phím, kết hợp với thiết kế chuyển mạch điện độc lập, có thể linh hoạt phù hợp với nhiều loại mẫu như tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn và vi sinh vật, cung cấp một giải pháp sáng tạo cho sự biểu hiện hiệu quả và duy trì kháng nguyên của protein LMHT VP2.

I. Vật liệu và phương pháp

1. Vật liệu thí nghiệm

Chủng vật chủ: E. coli BL21 (DE3) (bảo quản trong phòng thí nghiệm, qua trình tự ARN ribôxôm 16S để xác nhận nền tảng di truyền) gen mục tiêu: trình tự mã hóa virus loại O VP2 (được khuếch đại từ ARN virus thông qua RT-PCR, được xác minh bởi trình tự của một công ty thuốc thử) Chất mang biểu hiện: pET-32a (+) plasmid (chứa gen kháng ampicillin, được bảo quản trong phòng thí nghiệm) Thuốc thử: môi trường LB (một loại thuốc thử, được pha chế theo công thức tiêu chuẩn), ampicillin (một loại thuốc thử, nồng độ cuối cùng 100 μg/mL), IPTG (một loại thuốc thử, nồng độ cảm ứng 0).5mM), dung dịch đệm điện (dung dịch glycerin 10%, khử trùng màng lọc 0,22μm), bộ dụng cụ tinh khiết protein (thương hiệu nhất định, có chứa nhựa cán màng ái lực Ni-NTA), kháng thể đa dòng đặc hiệu cho virus lở mồm long móng (tự chế trong phòng thí nghiệm, được ELISA xác minh hiệu lực ≥1: 10000)

2. Dụng cụ chính

Venid Mini Pulse 399 Máy đục lỗ điện kinh tế (được trang bị cốc quay 0,1cm, thích hợp với chuyển đổi tế bào nhân sơ, chuyển vị điện độc lập hỗ trợ hệ thống thử nghiệm thay thế nhanh) Máy ly tâm đông lạnh tốc độ cao (một nhãn hiệu, độ chính xác tốc độ ± 50rpm, phạm vi kiểm soát nhiệt độ 4-40 ℃) Máy lắc nhiệt độ không đổi (một nhãn hiệu, phạm vi tốc độ quay 20-300rpm, độ chính xác kiểm soát nhiệt độ ± 0,1 ℃) Máy PCR định lượng huỳnh quang (một nhãn hiệu, được sử dụng để phát hiện số lượng bản sao plasmid tái tổ hợp) Hệ thống điện di SDS-PAGE (một nhãn hiệu, hỗ trợ chuẩn bị keo gradient nồng độ 8-16%) Máy đánh dấu (một nhãn hiệu nào đó phát hiện phạm vi bước sóng 200-800nm để phân tích ELISA)

2- Tên đề tài: Giải pháp nâng cao hiệu quả đầu tư phát triển kết cấu hạ tầng thương mại (

1. Xây dựng plasmid tái cấu trúc

Sau khi trình tự mã hóa VP2 được cắt bởi hai enzyme NdeI và XhoI, nó được kết nối với các vectơ pET-32a (+) được xử lý bằng cách cắt enzyme tương tự để chuyển thành tế bào thụ thể DH5α của E. coli. Các thuộc địa đơn lẻ được chọn để nuôi cấy dao động 37 ℃ trong môi trường LB có chứa ampicillin trong 12 giờ, plasmid được chiết xuất và xác minh điện di và giải trình tự gel agarose để có plasmid tái tổ hợp chính xác pET-32a-VP2.

2. Chuẩn bị tế bào trạng thái cảm thụ

50 μL E. coli BL21 (DE3) từ -80 ℃, được tiêm vào môi trường LB 5 mL, dao động 37 ℃ đến OD₆₀₀=0,6. Sau khi tắm nước đá vi khuẩn 30 phút, 10 phút ly tâm 4 ℃, 5.000 vòng/phút thu thập nấm, rửa 3 lần bằng dung dịch đệm điện chuyển lạnh trước, cuối cùng treo lại trong dung dịch glycerin 10%, điều chỉnh nồng độ tế bào đến 5 × 10 CFU/mL, được đóng gói thành 50 μL/ống, bảo quản trên băng hoặc đông lạnh nhanh nitơ lỏng - 80 ℃.

3. Tối ưu hóa chuyển đổi thủng điện

Một plasmid tái tổ hợp 5 μL (nồng độ 1 μg/μL) được lấy và trộn với các tế bào trạng thái cảm nhận 50 μL và được chuyển vào cốc điện 0,1 cm được làm lạnh trước. Chọn'Prokaryote Cell Mode'trên máy đục lỗ Venid Mini Pulse 399, đặt tham số điện áp là 1,8kV (theo giá trị tối ưu hóa trước khi thử nghiệm), nhấn nút'One Touch Start' trên màn hình cảm ứng và thiết bị tự động tạo ra xung sóng mũ có độ chính xác cao. Ngay sau khi kết thúc xung, môi trường LB không kháng 950 μL được thêm vào, hồi sức dao động 37 ℃ trong 1 giờ, 100 μL được phủ lên tấm LB có chứa ampicillin và các thuộc địa được đếm sau 12 giờ nuôi cấy 37 ℃ để tính tỷ lệ chuyển đổi.

4. Cảm ứng biểu hiện và tinh khiết protein

Nhân bản dương tính được chọn để cấy vào môi trường LB có chứa ampicillin 5mL, dao động 37 ℃ đến OD₆₀₀=0,8 và chuyển sang môi trường lên men 500mL theo tỷ lệ 1: 100. Khi OD₆₀₀₀ đạt 1,2, IPTG cảm ứng 4h, 4 ℃, 8.000 vòng/phút để thu thập nấm ly tâm được thêm vào. Sử dụng phương pháp phá vỡ siêu âm để phá vỡ các tế bào (công suất 300W, làm việc 3s/khoảng thời gian 5s, tổng cộng 30 lần), sau khi ly tâm thu thập sự thanh lọc (protein hòa tan) và kết tủa (bao hàm). Chất lỏng thượng lưu được tinh chế bằng cách phân loại ái lực Ni-NTA, rửa sạch bằng gradient imidazole 20-500mM, thành phần protein mục tiêu thu thập, độ tinh khiết phân tích điện di SDS-PAGE, nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford.

III. Phương pháp phân tích kháng nguyên

Kiểm tra Western blot

Protein VP2 tinh khiết sau khi được phân lập bằng SDS-PAGE được chuyển điện sang màng PVDF, sữa bột tách kem 5% được đóng trong 2h, thêm kháng thể đa dòng đặc hiệu của virus lở mồm long móng (pha loãng 1: 5000) để ủ 1h, sau khi rửa màng TBST 3 lần, thêm thẻ HRP cừu kháng thỏ IgG Dianti (pha loãng 1: 10000), sau khi ủ 1h với bộ dụng cụ phát quang ECL, hệ thống hình ảnh gel thu thập hình ảnh.

2. Phân tích định lượng ELISA

Protein tinh khiết được đóng gói bằng tấm 96 lỗ theo gói 1μg/mL, đóng kín 2h với 1% BSA sau khi qua đêm ở 4 ℃. Thêm huyết thanh dương tính với virus lở mồm long móng pha loãng gradient (độ pha loãng ban đầu 1: 100), ủ 1h ở 37 ℃, kháng thể IgG chống lợn được đánh dấu HRP (pha loãng 1: 5000) sau khi rửa tấm, ủ 30 phút ở 37 ℃, kết thúc phản ứng với 2M H₂ SO ₄ sau khi nhuộm TMB, phát hiện giá trị hấp thụ ánh sáng 450nm bằng máy đánh dấu enzyme. Sử dụng protein VP2 tự nhiên làm đối chứng dương tính, tính toán hoạt động kháng nguyên tương đối (ODvalue trong nhóm thử nghiệm/ODvalue trong nhóm đối chứng dương tính × 100%).

3. Thiết kế thí nghiệm tương phản

Thiết lập hai nhóm đối chứng: nhóm A sử dụng phương pháp chuyển đổi hóa học truyền thống (phương pháp CaCl₂), nhóm B sử dụng máy đục lỗ điện thông thường (thông số cố định: điện áp 2,0kV/cm, xung đơn), các điều kiện nuôi cấy còn lại phù hợp với nhóm thí nghiệm. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp chuyển đổi khác nhau đối với tỷ lệ chuyển đổi plasmid tái tổ hợp, biểu hiện hòa tan của protein VP2 và kháng nguyên.

IV. Kết quả và thảo luận

1. Phân tích hiệu quả chuyển đổi thủng điện

Venid Mini Pulse 399 đã xử lý chuyển đổi 6,5 × 10 CFU/μg trong nhóm thử nghiệm, cao hơn đáng kể so với 8,0 × 10 CFU/μg trong nhóm A và 3,2 × 10 CFU/μg trong nhóm B. Xét nghiệm PCR định lượng huỳnh quang cho thấy số lượng bản sao plasmid đơn khuẩn trong nhóm thí nghiệm tăng 25% so với nhóm B, cho thấy công nghệ xung sóng mũ có độ chính xác cao của nó đã cải thiện hiệu quả phân phối xuyên màng DNA ngoại lai. Hệ thống giám sát hồ quang thời gian thực của thiết bị có thể kiểm soát xác suất phát sinh tia lửa điện dưới 0,5%, tránh tổn thương không thể đảo ngược đối với màng tế bào do dao động năng lượng xung, do đó duy trì tỷ lệ sống sót cao của các tế bào trạng thái cảm nhận (nhuộm màu xanh Đài Loan cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào ≥90%).

2. Phân tích biểu hiện protein và độ hòa tan

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy một dải protein rõ ràng, trọng lượng phân tử khoảng 42 kDa, phù hợp với giá trị lý thuyết, xuất hiện trong nhóm thí nghiệm 4 giờ sau khi cảm ứng. Phân tích phần mềm ImageJ cho thấy các protein hòa tan trong nhóm thí nghiệm chiếm 58% tổng lượng biểu hiện, cao hơn đáng kể so với 22% ở nhóm A và 41% ở nhóm B. Phương pháp Bradford cho thấy 18,7 mg protein VP2 hòa tan cho mỗi lít nuôi cấy trong nhóm thí nghiệm, tăng 52% so với 12,3 mg ở nhóm B và gần 9 lần so với 2,1 mg ở nhóm A. Điều này được hỗ trợ bởi thiết kế thân thiện với tế bào của Mini Pulse 399, với các thông số xung tự động phù hợp với các đặc tính của màng tế bào prokaryocyte bằng thuật toán tích hợp, giảm gấp sai protein do căng thẳng tế bào và tăng hiệu quả biểu hiện hòa tan từ nguồn.

3. Đánh giá hoạt động kháng nguyên

Kết quả của Western blot cho thấy các protein tinh khiết trong nhóm thí nghiệm tạo ra một phản ứng cụ thể với kháng thể virus lở mồm long móng, với sức mạnh dải phù hợp với protein tự nhiên, trong khi nhóm A và nhóm B gây ra một dải phản ứng yếu do sự phức tạp của cơ thể được bao bọc. Phân tích định lượng ELISA cho thấy hoạt động kháng nguyên tương đối của histone trong phòng thí nghiệm là 89%, cao hơn đáng kể so với 65% ở nhóm B và 32% ở nhóm A. Phân tích lưỡng sắc ký tròn cho thấy histone thử nghiệm có hàm lượng gấp beta 35%, gần với 38% protein tự nhiên, chứng minh tính toàn vẹn cấu trúc bậc hai tốt hơn so với nhóm đối chứng, tiếp tục xác nhận vai trò bảo vệ của máy đục lỗ điện Venid đối với cấu hình protein trong quá trình chuyển đổi thiệt hại thấp.

V. Lợi thế kỹ thuật của thiết bị hợp tác với các thông số thử nghiệm

Venid Mini Pulse 399 cho thấy ba điểm mạnh cốt lõi trong nghiên cứu này:

Tối giản hóa hoạt động nâng cao hiệu quả: không cần gỡ lỗi các thông số phức tạp, chỉ cần thiết lập điện áp có thể bắt đầu, người mới hoạt động mất 40% thời gian so với máy đục lỗ truyền thống, cải thiện đáng kể hiệu quả thí nghiệm, đặc biệt thích hợp cho nhiều lô chuyển đổi sàng lọc.

Bảo vệ xung chính xác: Các xung sóng chỉ số chính xác cao kết hợp với giám sát hồ quang thời gian thực, kiểm soát tỷ lệ tử vong tế bào dưới 10% trong khi đảm bảo chuyển đổi hiệu quả, cung cấp môi trường vật chủ ổn định cho biểu hiện protein hòa tan.

Thích hợp cảnh đa dạng: Thiết kế ghế xoay điện độc lập hỗ trợ chuyển đổi nhanh chóng 0.1cm, 0.2cm và các thông số kỹ thuật khác nhau của cốc xoay điện. Nó có thể xử lý các mẫu nhỏ cỡ microgram và cũng tương thích với nhu cầu chuyển đổi thông lượng cao để đáp ứng tất cả các ứng dụng quy trình của phòng thí nghiệm từ nghiên cứu cơ bản đến tối ưu hóa quy trình.

Trong thí nghiệm, người ta phát hiện ra rằng nồng độ tế bào và các thông số điện áp cần phối hợp chặt chẽ: khi nồng độ tế bào cao hơn 8 × 10 CFU/mL, điện áp cần được điều chỉnh đến 1,6 kV để tránh điện trường cục bộ quá mạnh; Khi nồng độ glycerin dao động ± 2% trong bộ đệm điện, chức năng bù thông minh của thiết bị có thể tự động hiệu chỉnh năng lượng xung để đảm bảo hiệu quả chuyển đổi ổn định (RSD ≤ 3% giữa các lô). Những chi tiết này thể hiện khả năng điều khiển chính xác của thiết bị trong điều kiện thí nghiệm phức tạp, cung cấp sự đảm bảo đáng tin cậy cho tính lặp lại của công nghệ.

VI. Triển vọng ứng dụng

1. Sản xuất công nghiệp vắc-xin thú y

Hệ thống biểu hiện protonucleic VP2 được nghiên cứu và thiết lập có thể được áp dụng trực tiếp để sản xuất quy mô lớn vắc-xin tiểu đơn vị bệnh lở mồm long móng. Vị trí kinh tế và hiệu suất cao của Venid Mini Pulse 399 có thể giảm chi phí chuyển đổi lô đơn hơn 30%, kết hợp với quá trình lên men mật độ cao, hứa hẹn sẽ giảm chi phí sản xuất protein tái tổ hợp xuống 1/2 so với phương pháp truyền thống. Khả năng truy xuất nguồn gốc và ổn định thiết bị phù hợp với tiêu chuẩn GMP cung cấp hỗ trợ quan trọng cho hệ thống kiểm soát chất lượng của các doanh nghiệp sản xuất vắc-xin.

2. Sàng lọc thông lượng cao cho kháng nguyên đa mầm bệnh

Sự biểu hiện protein cấu trúc của nhiều loại virus gia súc và gia cầm như dịch tả lợn, thiết kế mô-đun của Mini Pulse 399 có thể nhanh chóng chuyển đổi các chủng vi khuẩn chủ (như E. coli, Salmonella), kết hợp với phụ kiện chuyển đổi điện 96 lỗ (có thể tùy chọn), thực hiện biểu hiện song song đa kháng nguyên và sàng lọc ban đầu kháng nguyên, rút ngắn chu kỳ thí nghiệm đơn mẫu truyền thống từ 72h xuống 48h, đẩy nhanh đáng kể quá trình nghiên cứu và phát triển vắc-xin mới.

3. Sinh học tổng hợp và phát triển thuốc thử chẩn đoán

Trong lĩnh vực phân phối các công cụ chỉnh sửa gen (chẳng hạn như các vi khuẩn kỹ thuật được đưa vào hệ thống CRISPR-Cas9) và chuẩn bị nguyên liệu cho bộ dụng cụ chẩn đoán, các đặc tính chuyển đổi có hại thấp của thiết bị có thể làm tăng sự biểu hiện hòa tan của các protein phức tạp, đặc biệt là các protein kháng nguyên giàu liên kết disulfide hoặc các vị trí glycosyl hóa. Ví dụ, trong các thuốc thử chẩn đoán phân loại virus lở mồm long móng, sự biểu hiện hoạt động cao của protein VP2 có thể làm tăng độ nhạy xét nghiệm ELISA lên 15%, cung cấp các công cụ xét nghiệm chính xác hơn cho các phòng thí nghiệm thú y cơ sở.

Với khả năng chuyển đổi hiệu quả cao, các tính năng thân thiện với tế bào và khả năng phù hợp linh hoạt, máy đục lỗ điện Venid Mini Pulse 399 trở thành công cụ lý tưởng để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện lõi thô. Thiết bị cung cấp hỗ trợ kỹ thuật 7 × 24 giờ và dịch vụ tối ưu hóa thông số chủng miễn phí, đã thông qua xác nhận của hàng chục doanh nghiệp thuốc thú y và phòng thí nghiệm của các trường đại học trong nước, thiết thực giúp các nhà nghiên cứu đột phá nút thắt biểu hiện protein tái tổ hợp, thúc đẩy nâng cấp công nghệ của ngành công nghiệp vắc-xin thú y và thuốc thử chẩn đoán.

Tài liệu tham khảo

Giới thiệu về Viện Nghiên cứu Tâm lý người sử dụng ma túy (PSD) ( Trần Vĩ; Hàn Văn Du; V5-0602 (1) Trần Quốc Tuấn

2. Phân tích các epitope trung lập trên virus bệnh miệng chân. [J]. E Pfaff; H J Thiel; E Beck; K Strohmaier; H Schaller, Tạp chí Virology.1988, 第6期

3. Phát hiện vi-rút miệng chân ở gia súc được tiêm chủng. [J]. P; Moonen; L; Jacobs; A; Crienen; A; Dekker, vi sinh học thú y.2004, 第3-4期

4. Phát triển và sử dụng một protein tái kết hợp 3ABC biotinylated trong một ELISA cạnh tranh giai đoạn rắn để phát hiện kháng thể chống lại virus bệnh muối chân. [J]. Kitching P; Chu EM; Galic B; Clavijo A; Hole K, Tạp chí Phương pháp Virology.2004, 第2期

5. Sự phát triển của bệnh muối chân NSP ELISA và so sánh của nó với các phương pháp chẩn đoán khác biệt [J]. Kweon CH; Ko YJ; Không, JJ. Choi KS; Sohn HJ; Lee SY; Lee KN; Kim WI, Vaccine.2003, 第13期

6. Sự khác biệt của động vật hồi phục từ những động vật được tiêm chủng chống lại bệnh muối chân bằng một peptide ELISA [J]. Cảnh sát Chen; Ye J; Thần F; Nhà J; Tại Walfield AM Vương CY; Brown F, Vaccine.1999, 第23期