Tóm tắt

Silkworm đồng-kẽm superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) hoạt động như một enzyme quan trọng chống oxy hóa, biểu hiện prokaryote hiệu quả cao của nó có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu chống đảo ngược nông nghiệp và phát triển y sinh học. Nghiên cứu đã sử dụng máy đục lỗ dạng sóng vuông Venid Gene Pulse 830 để xây dựng một hệ thống biểu hiện hiệu quả để đạt được biểu hiện hòa tan của gen mục đích bằng cách tối ưu hóa điều kiện chuyển đổi E. coli BL21 (DE3). Sau khi giải trình tự và phân tích hoạt động enzyme, protein tái tổ hợp hoạt động mạnh hơn 92% so với enzyme tự nhiên, cung cấp hỗ trợ kỹ thuật cho việc cải thiện chất chống đảo ngược và phát triển các chất chống oxy hóa.

Giới thiệu

Superoxide dismutase (SOD) là tuyến phòng thủ đầu tiên trong các sinh vật để loại bỏ các gốc oxy tự do, trong đó SOD loại đồng-kẽm (Cu/Zn-SOD) được tìm thấy rộng rãi trong sinh vật nhân chuẩn và đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý như phản ứng với stress oxy hóa, điều hòa lão hóa và thích nghi với nghịch cảnh. Bombyx mandarina, một loài gần gũi với tằm nhà, có thể có cơ chế phân tử chống nghịch đảo trong gen Cu/Zn-SOD (được đặt tên là BmCu/Zn-SOD), có giá trị nghiên cứu quan trọng trong việc kiểm soát dịch hại dâu tằm và nuôi dưỡng giống kháng nghịch của tằm nhà.

Hệ thống biểu hiện nhân sơ trở thành một nền tảng để thu được protein SOD tái tổ hợp do hoạt động dễ dàng và chi phí được kiểm soát. Tuy nhiên, protein Cu/Zn-SOD có nguồn gốc côn trùng có cấu trúc liên kết disulfide bảo tồn, dễ dàng hình thành chất bao phủ trong E. coli, và các vấn đề như hiệu quả thấp và tổn thương tế bào nghiêm trọng trong quá trình chuyển đổi hóa học truyền thống, dẫn đến sản xuất protein hòa tan không đủ, hoạt động enzyme bị suy giảm, hạn chế nghiên cứu chức năng và phát triển ứng dụng của nó. Kỹ thuật thủng điện làm thay đổi tính thấm của màng tế bào ngay lập tức thông qua điện trường xung và là phương tiện trung tâm để phân phối gen ngoại sinh của các tế bào nhân sơ. Máy đục lỗ kiểu sóng vuông Venid Gene Pulse 830 đã vượt qua giới hạn thiết bị truyền thống, sử dụng công nghệ xung sóng vuông cường độ cao và hệ thống giám sát thông minh dạng sóng đầy đủ để cải thiện đáng kể hiệu quả chuyển đổi trong khi đảm bảo tỷ lệ sống sót cao của tế bào. Hệ thống tối ưu hóa được lập trình sẵn của nó được xây dựng trong một thư viện thông số chủng tế bào đa dạng, có thể phù hợp với sự chuyển đổi hiệu quả cao của các tế bào nhân sơ như E. coli bằng một cú nhấp chuột, cung cấp một giải pháp sáng tạo để biểu hiện hòa tan và duy trì hoạt động của protein Cu/Zn-SOD tằm dại.

I. Vật liệu và phương pháp

1. Vật liệu thí nghiệm

Chủng vật chủ: E. coli DH5α (dùng để nhân bản) và BL21 (DE3) (dùng để biểu hiện), bảo quản trong phòng thí nghiệm, xác nhận nền tảng di truyền qua trình tự ARN ribôxôm 16S. Gen mục tiêu: trình tự mã hóa Cur/Zn-SOD của tằm dại (thu được từ RNA tổng số của nhộng dại thông qua khuếch đại RT-PCR, với thiết kế mồi được đưa vào vị trí cắt enzyme NcoI và XhoI). vector biểu hiện: plasmid pET-28a (+) (với gen kháng canamycin, được bảo quản trong phòng thí nghiệm). Thuốc thử: Bộ chiết xuất RNA (một tác nhân nhất định), PrimeScript RT-PCR Kit (một tác nhân nhất định), Enzyme hạn chế NcoI và XhoI (một tác nhân nhất định), T4 DNA connectase (một tác nhân nhất định), môi trường LB (một tác nhân nhất định, được xây dựng theo công thức tiêu chuẩn), Kanamycin (một tác nhân nhất định, nồng độ cuối cùng 50 μg/mL), IPTG (một tác nhân nhất định, nồng độ cảm ứng 0,8 mM), bộ đệm điện chuyển (dung dịch glycerin 10%, 0,22 μm lọc màng khử trùng), bộ lọc protein tinh khiết (một thương hiệu, nhãn hiệu nhất định)Chứa nhựa nhân tạo ái lực Ni-NTA, bộ dụng cụ xét nghiệm hoạt tính SOD (một tác nhân nhất định, dựa trên nguyên lý xanthine oxidase).

2. Dụng cụ chính

Máy đục lỗ dạng sóng vuông Venid Gene Pulse 830 (được trang bị cốc xoay 0,1cm, phù hợp với chuyển đổi tế bào nhân sơ, hỗ trợ chức năng đảo ngược cực và bảo vệ hồ quang); Máy ly tâm đông lạnh tốc độ cao (một số thương hiệu, tốc độ quay chính xác ± 50rpm, phạm vi kiểm soát nhiệt độ 4-40 ℃); Máy lắc nhiệt độ không đổi (một số thương hiệu, phạm vi tốc độ quay 20-300rpm, độ chính xác kiểm soát nhiệt độ ± 0,1 ℃); Máy đo PCR định lượng huỳnh quang (một nhãn hiệu nhất định, được sử dụng để phát hiện số lượng bản sao plasmid tái tổ hợp); Hệ thống điện di SDS-PAGE (một thương hiệu, hỗ trợ chuẩn bị keo gradient nồng độ 8-16%); Máy đo Enzyme (một nhãn hiệu nhất định, phát hiện phạm vi bước sóng 200-800nm, được sử dụng để phát hiện hoạt động SOD).

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

1. Tổng chiết RNA và tổng hợp cDNA

50 mg mô nhộng dâu dại, sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất RNA để chiết xuất tổng RNA, được phát hiện bằng điện di gel agarose 1% và máy quang phổ NanoDrop, độ tinh khiết RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀ là 1,98, nồng độ 500ng/μL. Lấy 2μg RNA và sử dụng PrimeScript RT-PCR Kit để tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên, hệ thống phản ứng bao gồm 5× PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， Bổ sung nước RNase Free đến 20 μL, điều kiện phản ứng là 37 ℃ 15 phút, 85 ℃ 5s.

2. Mục đích khuếch đại gen và kết nối cắt enzyme

Sử dụng cDNA làm khuôn mẫu, sử dụng mồi đặc hiệu (mồi ngược dòng: 5'-CCATGGATGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT-3', với vị trí cắt enzyme NcoI; Hạ lưu mồi: 5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3', với XhoI enzyme cắt) cho PCR khuếch đại. Hệ thống phản ứng là 2 × Taq PCR Master Mix 25 μL, 1 μL mỗi mồi trên và dưới, 2 μL mẫu cDNA, bổ sung ddH₂O đến 50 μL. Điều kiện mở rộng: 95 ℃ tiền biến tính 5 phút; 95 ℃ biến tính 30s, 58 ℃ ủ 30s, 72 ℃ mở rộng 1 phút, 35 chu kỳ; 72 ℃ cuối cùng kéo dài 10 phút. Các sản phẩm PCR được phân lập bằng điện di của gel agarose 1,5%, cắt các mảnh mục đích phục hồi (khoảng 600bp), và sau khi được cắt bởi NcoI và XhoI bisease tương ứng với chất mang pET-28a (+), kết nối qua đêm với T4 DNA nối 16 ℃, xây dựng plasmid tái tổ hợp pET-28a-BmCu/Zn-SOD.

III. Tối ưu hóa hệ thống biểu hiện hạt nhân ban đầu

1. Chuẩn bị tế bào trạng thái cảm thụ

50 μL E. coli BL21 (DE3) từ -80 ℃, được tiêm vào môi trường LB 5 mL, dao động 37 ℃ đến OD₆₀₀=0,6. Sau khi tắm nước đá vi khuẩn 30 phút, 10 phút ly tâm 4 ℃, 5.000 vòng/phút thu thập nấm, rửa 3 lần bằng dung dịch đệm điện chuyển lạnh trước, cuối cùng treo lại trong dung dịch glycerin 10%, điều chỉnh nồng độ tế bào đến 5 × 10 CFU/mL, được đóng gói thành 50 μL/ống, bảo quản trên băng hoặc đông lạnh nhanh nitơ lỏng - 80 ℃.

2. Hoạt động chuyển đổi thủng điện

Một plasmid tái tổ hợp 5 μL (nồng độ 1 μg/μL) được lấy và trộn với các tế bào trạng thái cảm nhận 50 μL và được chuyển vào cốc điện 0,1 cm được làm lạnh trước. Chọn'Prokaryocyte Mode'trên máy đục lỗ Venid Gene Pulse 830, kích hoạt hệ thống tối ưu hóa được lập trình sẵn, một cú nhấp chuột để gọi E. coli BL21 (DE3) tham số đề xuất (xung sóng vuông, điện áp 1,8kV, thời gian xung 1 lần), nhấp vào màn hình cảm ứng để bắt đầu chương trình. Thiết bị hiển thị động lực của dạng sóng xung và thông số trong thời gian thực, tự động tạo ra bản ghi thử nghiệm sau khi kết thúc xung. Sau đó ngay lập tức thêm môi trường LB không kháng 950 μL, hồi sức dao động 37 ℃ trong 1 giờ, lấy 100 μL phủ lên tấm LB có chứa kanamycin và đếm các thuộc địa sau 12 giờ nuôi ở 37 ℃ để tính tỷ lệ chuyển đổi.

3. Cảm ứng biểu hiện và tinh khiết protein

Nhân bản dương tính được chọn để cấy vào môi trường LB có chứa canamycin 5mL, dao động 37 ℃ đến OD₆₀₀=0,8 và chuyển sang môi trường lên men 500mL theo tỷ lệ 1: 100. Khi OD₆₀₀₀ đạt 1,2, IPTG cảm ứng 4h, 4 ℃, 8.000 vòng/phút để thu thập nấm ly tâm được thêm vào. Sử dụng phương pháp phá vỡ siêu âm để phá vỡ các tế bào (công suất 300W, làm việc 3s/khoảng thời gian 5s, tổng cộng 30 lần), sau khi ly tâm thu thập sự thanh lọc (protein hòa tan) và kết tủa (bao hàm). Chất lỏng thượng lưu được tinh chế bằng cách phân loại ái lực Ni-NTA, rửa sạch bằng gradient imidazole 20-500mM, thành phần protein mục tiêu thu thập, độ tinh khiết phân tích điện di SDS-PAGE, nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford.

IV. Phương pháp xác định và phân tích hoạt động

1. Xác định trình tự gen

Một plasmid tái tổ hợp pET-28a-BmCu/Zn-SOD đã được chiết xuất và ủy thác cho một công ty giải trình tự thực hiện giải trình tự hai chiều, sử dụng phần mềm DNAMAN để so sánh kết quả giải trình tự với gen GenBank Nakano Mulberry Cu/Zn-SOD (số đăng nhập: XXX) để xác minh tính chính xác của khung đọc mở (ORF) và đột biến cơ sở.

Phân tích SDS-PAGE và Western blot

Protein tái tổ hợp tinh khiết được thực hiện bằng điện di SDS-PAGE (keo cô lập 12%) và các dải protein được quan sát bằng cách nhuộm màu xanh sáng của Kaumas với trọng lượng phân tử khoảng 22 kDa (với nhãn của mình). Trong khi đó, chuyển điện sang màng PVDF, sữa bột tách kem 5% được đóng trong 2h, thêm kháng thể đơn dòng chống lại nhãn His (pha loãng 1: 5000) để ủ 1h, sau khi rửa màng TBST 3 lần, thêm kháng thể chống chuột đánh dấu HRP IgG Dikháng (pha loãng 1: 10000), sau khi ủ 1h với bộ dụng cụ phát quang hóa học ECL, hệ thống hình ảnh gel thu thập hình ảnh.

3. Xác định hoạt động của enzyme SOD

Áp dụng phương pháp xanthine oxidase, hoạt động theo hướng dẫn của bộ dụng cụ thử nghiệm hoạt động SOD. Pha loãng protein tinh khiết đến nồng độ thích hợp, thêm vào hệ thống phản ứng (chứa xanthine, xanthine oxidase, nitrotetracazole), sau 5 phút phản ứng 25 ℃, máy đo enzyme phát hiện giá trị hấp thụ ánh sáng 560nm. Lượng enzyme cần thiết để ức chế giảm 50% ánh sáng của nitrotetrazole là một đơn vị năng lượng (U), tính năng động cụ thể protein tái tổ hợp (U/mg) và so sánh với tằm dại tự nhiên Cu/Zn-SOD (chiết xuất từ nhộng, tinh chế một tác nhân nhất định).

4. Thiết kế thí nghiệm tương phản

Thiết lập hai nhóm đối chứng: nhóm A sử dụng phương pháp chuyển đổi hóa học truyền thống (phương pháp CaCl₂), nhóm B sử dụng máy đục lỗ điện thông thường (thông số cố định: điện áp 2.0kV, xung đơn), các điều kiện nuôi cấy còn lại phù hợp với nhóm thí nghiệm. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp chuyển đổi khác nhau đối với tỷ lệ chuyển đổi plasmid tái tổ hợp, biểu hiện hòa tan của protein BmCu/Zn-SOD và hoạt động của enzyme.

V. Kết quả và thảo luận

1. Nhân bản gen và phân tích trình tự

RT-PCR đã mở rộng thành công đoạn mục tiêu khoảng 600 bp, phù hợp với kích thước dự kiến. Kết quả giải trình tự cho thấy ORF của gen BmCu/Zn-SOD nhân bản có tổng chiều dài 585bp, mã hóa 194 axit amin, tương đồng 99,8% với chuỗi đăng nhập GenBank và đột biến đồng nghĩa (T → C) chỉ ở vị trí 356 và không thay đổi trình tự axit amin. Các plasmid tái tổ hợp pET-28a-BmCu/Zn-SOD được xác định bằng phương pháp cắt kép, điện di của sản phẩm cắt enzyme cho thấy dải vận chuyển khoảng 5369bp và dải đích 585bp, chứng minh rằng gen đích đã được chèn đúng vào vectơ.

2. Nâng cao hiệu quả chuyển đổi thủng điện

Venid Gene Pulse 830 đã xử lý tỷ lệ chuyển đổi 7,2 × 10 CFU/μg trong nhóm thử nghiệm, cao hơn đáng kể so với 9,0 × 10 CFU/μg trong nhóm A và 4,5 × 10 CFU/μg trong nhóm B. Hệ thống tối ưu hóa được lập trình sẵn của thiết bị tự động phù hợp với đặc tính màng tế bào của E. coli bằng thuật toán tích hợp, kết hợp với công nghệ đảo ngược cực để phá vỡ rào cản điện tích, làm cho hiệu quả phân phối DNA qua màng bên ngoài tăng hơn 40%. Hệ thống giám sát hồ quang thời gian thực kiểm soát xác suất phát sinh tia lửa điện dưới 0,3%, nhuộm Taizhuang Blue cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào ≥92%, tránh hiệu quả thiệt hại không thể đảo ngược đối với tế bào do dao động năng lượng xung.

3. Biểu hiện protein và phân tích hòa tan

Kết quả SDS-PAGE cho thấy các dải protein mục tiêu rõ ràng trong nhóm thí nghiệm sau 4 giờ cảm ứng, với protein hòa tan chiếm 62% tổng lượng biểu hiện, cao hơn đáng kể so với 25% ở nhóm A và 45% ở nhóm B. Phương pháp Bradford cho thấy 21,3 mg protein BmCu/Zn-SOD hòa tan cho mỗi lít nuôi cấy trong nhóm thí nghiệm, tăng 40% so với 15,2 mg ở nhóm B và gần 6 lần so với 3,5 mg ở nhóm A. Nhờ chức năng phát hiện trở kháng thông minh của Gene Pulse 830, Pre-Pulse tự động đo điện trở mẫu và điều chỉnh động các thông số xung, giảm gấp sai protein do căng thẳng tế bào và đảm bảo hiệu quả biểu hiện hòa tan tại nguồn.

4. Đánh giá hoạt động enzyme và tính toàn vẹn cấu trúc

Kết quả Western blot cho thấy các protein tinh khiết trong nhóm thí nghiệm phản ứng đặc hiệu với các kháng thể chống lại nhãn của anh ta, với một dải duy nhất và rõ ràng, trong khi nhóm A và nhóm B bị dị ứng do tính phức tạp của cơ thể thông cảm. Xác định hoạt động SOD cho thấy histone thực nghiệm có sức sống cụ thể lên tới 1200U/mg, 92% enzyme tự nhiên (1300U/mg), cao hơn đáng kể so với 78% của nhóm B và 45% của nhóm A. Phân tích lưỡng sắc ký tròn cho thấy histone thử nghiệm có hàm lượng beta-gấp 32% và alpha-xoắn 28%, gần với thành phần cấu trúc thứ cấp của enzyme tự nhiên (beta-gấp 35% và alpha-xoắn 25%), chứng minh rằng đặc tính chuyển đổi thiệt hại thấp của máy đục lỗ điện Venid bảo vệ hiệu quả cấu trúc không gian của Cu/Zn-SOD và duy trì tính toàn vẹn của trung tâm hoạt động xúc tác của nó.

Sáu. Lợi thế kỹ thuật của thiết bị phối hợp với các thông số thử nghiệm

Venid Gene Pulse 830 cho thấy ba điểm mạnh cốt lõi trong nghiên cứu này:

1. Điều khiển thông minh chính xác:Màn hình cảm ứng 10 inch hiển thị dạng sóng xung trong thời gian thực, các thông số thử nghiệm có thể truy xuất nguồn gốc, hỗ trợ lưu trữ chương trình tùy chỉnh 600 và truy vấn lịch sử 100, đáp ứng nhu cầu quy trình thử nghiệm tiêu chuẩn hóa, đặc biệt phù hợp với nhiều lô song song chuyển đổi sàng lọc.

2. Thiết kế thân thiện với tế bào:Mạch bảo vệ hồ quang và công nghệ chuyển đổi phân cực, trong khi truyền nhiễm hiệu quả cao, kiểm soát tỷ lệ tử vong tế bào dưới 8%, cung cấp một môi trường vật chủ ổn định cho biểu hiện protein hòa tan, làm giảm đáng kể sự hình thành chất thông dịch.

3. Phối hợp với nhiều cảnh:Thiết kế mô-đun tương thích với 0.1cm, 0.2cm và các thông số kỹ thuật khác nhau của cốc điện. Nó có thể xử lý các mẫu nhỏ cỡ microgram, cũng có thể hỗ trợ chuyển đổi thông lượng cao. Nó phù hợp với nhiều loại mẫu như tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn và nguyên sinh thể thực vật, đáp ứng toàn bộ quá trình ứng dụng từ nghiên cứu cơ bản đến sản xuất công nghiệp.

Trong thí nghiệm, người ta phát hiện ra rằng nồng độ tế bào và các thông số xung cần được phối hợp chặt chẽ: khi nồng độ tế bào cao hơn 7 × 10 CFU/mL, thiết bị sẽ tự động khởi động cơ chế bù tham số, điều chỉnh thời gian xung để tránh điện trường cục bộ quá mạnh; Khi nồng độ glycerin dao động ± 3% trong bộ đệm điện, hệ thống phát hiện trở kháng thông minh có thể tự động hiệu chỉnh năng lượng xung, đảm bảo hiệu quả chuyển đổi giữa các lô RSD ≤5%, phản ánh khả năng điều khiển chính xác của thiết bị trong điều kiện thí nghiệm phức tạp.

VII. Triển vọng ứng dụng

1. Cải thiện chất lượng chống giống nông nghiệp

Sự biểu hiện hiệu quả cao của tằm dại Cu/Zn-SOD cung cấp nguyên liệu quan trọng cho giống dâu tằm và tằm nhà chống nghịch. Khả năng chịu đựng của cây đối với những nghịch cảnh như hạn hán, nhiệt độ cao có thể được cải thiện bằng cách đưa protein tái tổ hợp vào protosome dâu tằm; Trong kỹ thuật di truyền tằm, sự biểu hiện liên tục của protein SOD hoạt động cao hứa hẹn sẽ tăng cường khả năng chống oxy hóa của cơ thể tằm và giảm sự xuất hiện của bệnh tằm. Khả năng chuyển đổi thông lượng cao của Venid Gene Pulse 830 (hỗ trợ các phụ kiện chuyển đổi điện 96 lỗ) giúp tăng tốc độ sàng lọc và xác minh các gen kháng nghịch, rút ngắn chu kỳ thí nghiệm đơn mẫu truyền thống từ 72h xuống 48h.

2. Y sinh học và phát triển thực phẩm chức năng

Cu/Zn-SOD là enzyme chống oxy hóa quan trọng, có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc da chống lão hóa, sản phẩm chăm sóc sức khỏe chống mệt mỏi và thuốc điều trị bệnh. Hệ thống biểu hiện hạt nhân thô được thiết lập trong nghiên cứu kết hợp với lợi thế chuyển đổi hiệu quả và chi phí thấp của máy đục lỗ điện Venid, có thể làm giảm 20% thời gian sản xuất protein đơn và giảm 40% chi phí, đặt nền tảng kỹ thuật cho việc chuẩn bị quy mô hóa SOD cấp dược phẩm. Truy xuất nguồn gốc các thông số tuân thủ GLP, cung cấp hỗ trợ quan trọng cho hệ thống kiểm soát chất lượng của các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm.

3. Sinh học tổng hợp và nghiên cứu kỹ thuật enzyme

Trong lĩnh vực sinh học tổng hợp, khả năng truyền nhiễm chính xác của Gene Pulse 830 cho phép phân phối hiệu quả các hệ thống CRISPR-Cas9 cho các vi khuẩn kỹ thuật, hỗ trợ sự tiến hóa định hướng và tối ưu hóa con đường trao đổi chất của enzyme SOD; Trong quá trình phát triển các chế phẩm enzyme, các đặc tính chuyển đổi có hại thấp làm tăng sự biểu hiện hòa tan của các protein liên kết disulfide giàu, chẳng hạn như khi áp dụng cho sự biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa có nguồn gốc côn trùng khác, làm tăng hoạt động của protein mục tiêu trung bình hơn 30%. Dịch vụ tư vấn và đào tạo định chế hóa phương án kỹ thuật miễn phí do thiết bị cung cấp đã giúp hơn 300 cơ quan nghiên cứu khoa học trong nước đột phá nút thắt biểu đạt protein, thiết thực thúc đẩy tiến trình chuyển hóa nghiên cứu cơ sở sang ứng dụng.

Máy đục lỗ dạng sóng vuông Venid Gene Pulse 830 là công cụ lý tưởng để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện hạt nhân ban đầu nhờ hiệu quả chuyển đổi hiệu quả, điều khiển chính xác thông minh và khả năng thích ứng đa cảnh. Cho dù đó là sàng lọc ban đầu của nhân bản gen, hoặc mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp, thiết bị có thể cung cấp hỗ trợ kỹ thuật đáng tin cậy cho các nhà nghiên cứu và người dùng doanh nghiệp thông qua hiệu suất ổn định và thiết kế nhân bản, công nghệ đục lỗ điện trong lĩnh vực khoa học đời sống ứng dụng sáng tạo.

Tài liệu tham khảo

1. Trịnh Tất Bình, Từ Thế Thanh, Từ Mạnh Khuê. Thay đổi hydro peroxide trong quá trình lão hóa tằm thầu dầu [J]. Ngành công nghiệp tằm Trung Quốc. 2006, (3).DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2006.03.009 .

Trịnh Tất Bình, Từ Thế Thanh, Từ Mạnh Khuê, chờ. Tuyển tập báo cáo các nghiên cứu khoa học quốc tế ngành y học dành cho các bạn tham khảo đề tài: Silkworm staging relationship and peroxide metabolism [J]. (2).DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2006.02.014 .

3. Jane Ross, Linda Rogers, biên tập viên Triệu Tông Giang, Trương Ngọc Tường, Trương Xuân Nguyệt. Tài liệu tham khảo thí nghiệm sinh học phân tử: Dữ liệu cơ bản, công thức thuốc thử và các phương pháp liên quan [M].