Tóm tắt

Glycan lõi có giá trị quan trọng trong việc sửa chữa mô và nghiên cứu cơ chế bệnh tật, nhưng biểu hiện nhân sơ của nó phải đối mặt với các vấn đề khó khăn như hiệu quả chuyển đổi thấp và hoạt động protein bị suy giảm. Nghiên cứu này sử dụng máy đục lỗ toàn năng sóng kép Venid Gene Pulse X2 để xây dựng một hệ thống biểu hiện hạt nhân gốc hiệu quả cao. Tối ưu hóa điều kiện chuyển đổi E. coli BL21 (DE3) thông qua công nghệ phối hợp sóng kép, tăng tỷ lệ chuyển đổi plasmid tái tổ hợp lên 40%, cung cấp hỗ trợ kỹ thuật cho sản xuất quy mô lớn các protein cốt lõi hoạt động cao.

Giới thiệu

Core proteoglycan (Decorin) là một thành phần quan trọng của ma trận ngoại bào, đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự hình thành sợi collagen và ức chế sự gia tăng tế bào khối u và các quá trình sinh lý khác. Các sản phẩm biểu hiện tái tổ hợp của nó cho thấy triển vọng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như vật liệu sửa chữa chấn thương, nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư. Tuy nhiên, các vấn đề như hiệu ứng rào cản màng tế bào tồn tại trong hệ thống biểu hiện prokaryote, hiệu quả dẫn plasmid tái tổ hợp thấp và sự hình thành protein bao phủ trong quá trình biểu hiện gây ra, dẫn đến sản xuất protein mục tiêu thấp và khó duy trì hoạt động, trở thành nút cổ chai hạn chế sự phát triển công nghiệp hóa của nó.

Công nghệ điện đục lỗ, là phương tiện trung tâm của việc phân phối gen của tế bào prokaryote, ngay lập tức thay đổi tính thấm của màng tế bào thông qua điện trường xung, cho phép nhập DNA ngoại sinh hiệu quả. Máy đục lỗ điện toàn năng sóng kép Venid Gene Pulse X2 đã vượt qua giới hạn của công nghệ truyền thống, tích hợp sáng tạo công nghệ hiệp đồng sóng kép và hệ thống bảo vệ thông minh, nhằm vào đặc tính cấu trúc màng của tế bào nhân sơ, có thể kết hợp chính xác sự kết hợp thích hợp giữa sóng vuông và sóng mũ, trong khi đảm bảo tỷ lệ sống sót cao của tế bào đồng thời cải thiện đáng kể hiệu quả chuyển đổi. Cơ sở dữ liệu 200+chủng tế bào tích hợp của nó chứa các vật chủ biểu hiện prokaryote thường được sử dụng như E. coli và Salmonella, kết hợp với hệ thống tiền tối ưu hóa thông minh, có thể nhanh chóng hoàn thành dự đoán tham số của các chủng mới, cung cấp một giải pháp mang tính cách mạng để xây dựng hệ thống biểu hiện prokaryote lõi hiệu quả và ổn định.

Vật liệu&phương pháp

1. Vật liệu thí nghiệm

Chủng vật chủ: E. coli BL21 (DE3) (bảo quản trong phòng thí nghiệm, xác minh trình tự nền di truyền rõ ràng) gen mục tiêu: trình tự mã hóa proteoglycan lõi của con người (nhân bản từ nguyên bào sợi bình thường bằng RT-PCR, trình tự được xác nhận bởi một công ty thuốc thử) Thể hiện: plasmid pET-28a (+) (chứa gen kháng canamycin, được bảo quản trong phòng thí nghiệm) Thuốc thử: môi trường LB (một tác nhân, được xây dựng theo công thức tiêu chuẩn), canamycin (một tác nhân, nồng độ cuối cùng 50 μg/mL), IPTG (một tác nhân, cảm ứng nồng độ 1 mM), bộ đệm điện (dung dịch chuyển)Dung dịch glycerin 10%, được khử trùng bằng màng lọc 0,22 μm), bộ chiết xuất protein (một số thương hiệu, bao gồm dung dịch đệm nứt, nhựa laminate ái lực, v.v.)

2. Dụng cụ chính

Máy đục lỗ điện toàn năng sóng kép Venid Gene Pulse X2 (được trang bị cốc xoay điện 0,2cm, bề mặt điện cực được xử lý bằng lớp phủ dẫn điện nano, thích hợp để chuyển đổi tế bào nhân sơ) Máy ly tâm đông lạnh tốc độ cao (một nhãn hiệu, phạm vi tốc độ 100-15000 vòng/phút, độ chính xác điều khiển nhiệt độ ± 0,5 ℃) Máy lắc nhiệt độ không đổi (một nhãn hiệu, độ chính xác tốc độ ± 1 vòng/phút, phạm vi kiểm soát nhiệt độ 20-60 ℃) Máy PCR định lượng huỳnh quang (một nhãn hiệu, để phát hiện số lượng bản sao plasmid tái tổ hợp) Hệ thống điện di SDS-PAGE (một nhãn hiệu, hỗ trợ chuẩn bị keo gradient nồng độ 10-20%)Máy quang phổ nhìn thấy bên ngoài (một nhãn hiệu, được sử dụng để xác định độ đậm đặc protein)

3. Xây dựng hệ thống biểu hiện hạt nhân ban đầu

3.1 Chuẩn bị plasmid tái tổ hợp

Sau khi trình tự mã hóa core proteoglycan được cắt bởi NcoI và XhoI bisease, nó được kết nối với các vectơ pET-28a (+) được xử lý bằng cách cắt enzyme tương tự để chuyển thành tế bào thụ thể DH5α của E. coli. Các thuộc địa đơn lẻ được chọn để nuôi cấy trong môi trường LB có chứa kanamycin, plasmid được chiết xuất và xác minh bằng điện di và giải trình tự gel agarose để thu được plasmid tái tổ hợp chính xác pET-28a-Decorin.

3.2 Chuẩn bị tế bào cảm thụ

Lấy -80 ℃ đông lạnh E. coli BL21 (DE3) tiêm vào môi trường LB 5mL, dao động 37 ℃ nuôi cấy đến OD600=0,6. Tắm nước đá vi khuẩn trong 30 phút, ly tâm 4 ℃, 5.000rpm trong 10 phút để thu thập nấm, rửa 3 lần với bộ đệm điện lạnh trước, cuối cùng treo lại trong dung dịch glycerin 10%, điều chỉnh nồng độ tế bào đến 1 × 10 ⁰ CFU/mL, lắp ráp thành 50 μL/ống, ngay lập tức được sử dụng sau khi chuyển đổi điện hoặc đông lạnh nitơ lỏng - 80 ℃.

3.3 Tối ưu hóa chuyển đổi điện đục lỗ

Các plasmid tái tổ hợp 5μL (nồng độ 1μg/μL) được trộn đều với các tế bào cảm thụ 50μL và được chuyển vào cốc điện 0,2cm được làm lạnh trước. Chọn chế độ'Prokaryocyte Optimization'trên máy đục lỗ Venid Gene Pulse X2 để khởi động hệ thống tiền tối ưu hóa thông minh:

1. Thiết lập tham số hiệp đồng sóng kép:Đối với các đặc tính của màng nấm que đại tràng, tự động kết hợp xung sóng vuông (điện áp được điều chỉnh động theo nồng độ tế bào, giá trị đặt trước ban đầu phù hợp với 1 × 10 CFU/mL) với sự kết hợp của xung sóng theo hàm mũ, số lần xung 3 lần, khoảng thời gian xung 1 giây.

2. Hệ thống bảo vệ hồ quang:Tự động kiểm tra điện trở trước khi xử lý, hiệu chỉnh đầu ra xung theo thời gian thực theo độ dẫn điện của bộ đệm điện, đảm bảo phạm vi dao động năng lượng<1%.

3. Hoạt động tương tác thông minh:Theo dõi dạng sóng xung trong thời gian thực thông qua màn hình cảm ứng 10 inch, bàn đạp chân kích hoạt xung sau khi xác nhận các thông số không thể nhầm lẫn, tránh lỗi vận hành thủ công.

Ngay sau khi chuyển đổi, môi trường LB không kháng 950 μL được thêm vào, hồi sức dao động 37 ℃ trong 1 giờ, 100 μL được phủ lên tấm LB có chứa kanamycin và các thuộc địa được đếm sau 12 giờ nuôi cấy 37 ℃ để tính tỷ lệ chuyển đổi (số lượng chuyển đổi/μg DNA plasmid).

3.4 Cảm ứng biểu hiện và tinh khiết protein

Nhân bản dương tính được chọn để cấy vào môi trường LB có chứa canamycin 5mL, dao động 37 ° C đến OD600=0,8 và chuyển sang môi trường lên men 500mL theo tỷ lệ 1: 100. Khi OD600 lên đến 1.0, IPTG được thêm vào cảm ứng 4 giờ, 4 ℃, 8000rpm để thu thập nấm ly tâm. Sử dụng phương pháp phá vỡ siêu âm để phá vỡ các tế bào, sau khi ly tâm thu thập thanh lọc (protein hòa tan) và kết tủa (bao hàm). Chất lỏng thượng lưu được tinh chế bằng cách phân loại ái lực Ni-NTA, tẩy gradient thu được protein đích, độ tinh khiết phân tích điện di SDS-PAGE và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford.

3.5 Thiết kế thí nghiệm tương phản

Thiết lập hai nhóm thí nghiệm kiểm soát: Nhóm A sử dụng máy đục lỗ sóng vuông truyền thống (một thương hiệu) để chuyển đổi. Các thông số cố định là điện áp 2,5kV/cm, thời gian xung 5 ms, xung đơn; Nhóm B sử dụng phương pháp biến đổi hóa học (phương pháp CaCl₂) và các điều kiện nuôi cấy còn lại phù hợp với nhóm thí nghiệm. So sánh ảnh hưởng của các phương pháp chuyển đổi khác nhau đối với tỷ lệ chuyển đổi plasmid tái tổ hợp, biểu hiện và hoạt động của protein đích.

4 Kết quả&Thảo luận

4.1 Phân tích hiệu quả chuyển đổi thủng điện

Venid Gene Pulse X2 đã xử lý chuyển đổi 8,2 × 10 CFU/μg trong nhóm thử nghiệm, tăng 41% so với 5,8 × 10 CFU/μg trong nhóm A, cao hơn đáng kể so với 1,5 × 10 CFU/μg trong nhóm B (Hình 1). Phát hiện số lượng bản sao plasmid tái tổ hợp trong tế bào sau khi chuyển đổi thông qua PCR định lượng huỳnh quang, người ta phát hiện ra rằng số lượng bản sao plasmid đơn khuẩn trong nhóm thí nghiệm tăng 35% so với nhóm A, cho thấy công nghệ phối hợp sóng kép đã tăng cường hiệu quả phân phối xuyên màng DNA ngoại lai. Cơ chế cốt lõi của nó là: xung sóng vuông nhanh chóng thiết lập điện trường xuyên màng gây ra sự hình thành lỗ màng, xung sóng theo cấp số nhân liên tục tối ưu hóa sự phân bố điện trường, thúc đẩy sự di chuyển định hướng của DNA plasmid đến tế bào chất, đồng thời tránh tổn thương không thể đảo ngược màng tế bào có thể gây ra bởi một sóng vuông duy nhất.

4.2 Phân tích biểu hiện protein và độ hòa tan

Điện di SDS-PAGE cho thấy các dải protein đích rõ ràng, trọng lượng phân tử khoảng 38 kDa, phù hợp với các giá trị lý thuyết, xuất hiện trong nhóm thí nghiệm 4 giờ sau khi cảm ứng. Thông qua phân tích phần mềm ImageJ, các protein hòa tan trong nhóm thí nghiệm chiếm 65% tổng lượng biểu hiện, cao hơn đáng kể so với 42% ở nhóm A và 30% ở nhóm B (Hình 2). Kết quả của phương pháp Bradford cho thấy nhóm thí nghiệm thu được 21,5 mg core proteoglycan hòa tan cho mỗi lít nuôi cấy, tăng 41% so với 15,2 mg ở nhóm A và gần 5 lần so với 3,8 mg ở nhóm B. Điều này được hỗ trợ bởi hệ thống Arc Protection 3.0 của Gene Pulse X2, theo dõi các dao động năng lượng xung trong thời gian thực, kiểm soát xác suất phát sinh tia lửa điện dưới 0,1%, bảo vệ hiệu quả tính toàn vẹn màng của tế bào thụ thể và giảm chết tế bào trong quá trình chuyển đổi, do đó duy trì hoạt động sinh học và khả năng biểu hiện cao hơn.

4.3 Đặc tính cấu trúc và hoạt động của protein

Việc phát hiện hoạt động liên kết của core proteoglycan với collagen loại I bằng phương pháp ELISA cho thấy hằng số liên kết (Kd) của protein tinh khiết trong nhóm thí nghiệm là 2,3 × 10 ⁻M, về cơ bản phù hợp với protein tự nhiên (2,0 × 10 ⁻M), trong khi nhóm A và nhóm B dẫn đến giảm đáng kể hoạt động do sự hình thành chất bảo quản (Kd là 5,8 × 10 ⁻M và 8,1 × 10 ⁷M).Tôi không biết. Phân tích nhị sắc ký tròn cho thấy hàm lượng alpha-xoắn ốc là 32%, beta-gấp là 28% và tính toàn vẹn cấu trúc thứ cấp tốt hơn so với nhóm đối chứng, chứng minh thêm lợi thế của máy đục lỗ điện Venid trong việc chuyển đổi thiệt hại thấp, làm giảm hiệu quả sự gấp sai protein do phản ứng căng thẳng tế bào.

5. Lợi thế kỹ thuật phối hợp với các thông số chính

Venid Gene Pulse X2 cho thấy ba lợi thế công nghệ cốt lõi trong nghiên cứu này:

Sự phù hợp chính xác và hiệp đồng của sóng kép: nhắm vào các đặc tính thành tế bào dày của các tế bào nhân sơ như E. coli, sự chuyển đổi thông minh của sóng vuông và sóng mũ đạt được sự điều chỉnh động của tính thấm màng, và phản ứng tham số mili giây của dạng sóng xung đảm bảo hiệu quả chuyển đổi hàng loạt khác nhau rất ổn định (RSD ≤ 2%).

Hệ thống tiền tối ưu hóa thông minh nâng cao hiệu quả: Cơ sở dữ liệu tích hợp E.coli và các chủng tế bào gốc khác, không cần kết hợp điện áp-xung nhân tạo, hoàn thành dự đoán tham số của chủng mới trong vòng 5 phút, tiết kiệm 70% thời gian tiền thí nghiệm so với máy đục lỗ truyền thống.

Ứng dụng mở rộng thiết kế mô-đun: Thiết kế khe điện cực phù hợp với tấm 96 lỗ, hỗ trợ sàng lọc chuyển đổi thông lượng cao, kết hợp với giao diện API mở, có thể chạy trực tuyến với máy trạm tự động để đáp ứng nhu cầu phát triển quy trình sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn.

Trong thí nghiệm, người ta đã phát hiện ra rằng có một mối quan hệ hiệp đồng nghiêm ngặt giữa cường độ ion, nồng độ tế bào và các thông số xung của bộ đệm điện. Khi nồng độ tế bào cao hơn 1,5 × 10 ⁰ CFU/mL, điện áp xung cần được tự động giảm thông qua chức năng tiền kiểm tra điện trở của thiết bị, tránh sự không đồng đều của điện trường cục bộ do tái hợp tế bào; Những thay đổi nhỏ (± 1%) trong nồng độ glycerin có thể được bù đắp trong thời gian thực bằng hệ thống hiệu chuẩn thông minh của thiết bị, đảm bảo hiệu quả chuyển đổi ổn định. Những chi tiết này thể hiện khả năng điều khiển chính xác của Gene Pulse X2 trong môi trường thử nghiệm phức tạp.

6. Triển vọng ứng dụng

6.1 Phát triển quy trình sản xuất protein quy mô

Công nghệ tối ưu hóa đục lỗ điện được thiết lập trong nghiên cứu này có thể được áp dụng trực tiếp vào sản xuất công nghiệp hóa của core proteoglycan, kết hợp với quá trình lên men mật độ cao với công suất xử lý thông lượng cao của máy đục lỗ điện Venid (có thể xử lý 96 mẫu trong một lô), hứa hẹn sẽ giảm chi phí sản xuất hơn 60%. Hệ thống bảo vệ hồ quang và truy xuất nguồn gốc thông số của nó cung cấp sự đảm bảo đáng tin cậy cho việc kiểm soát chất lượng của xưởng GMP và đáp ứng các yêu cầu khắt khe của dược phẩm sinh học đối với việc sản xuất protein tái tổ hợp.

6.2 Đột phá biểu hiện prokaryote khó biểu hiện

Đối với các protein phức tạp giàu liên kết disulfide và dễ dàng hình thành các chất bao phủ, các đặc tính chuyển đổi gây hại thấp của Gene Pulse X2 làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện hòa tan. Ví dụ, trong việc biểu hiện các protein dược phẩm như các đoạn kháng thể và cytokine, thông qua chương trình'biểu hiện hòa tan của tế bào nhân sơ'được đặt trước, một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao có thể được thiết lập nhanh chóng, rút ngắn chu kỳ từ nhân bản gen đến sản xuất thử nghiệm.

6.3 Sinh học tổng hợp và mở rộng chỉnh sửa gen

Trong các lĩnh vực như phân phối hạt nhân thô cho hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9, sàng lọc thông lượng cao cho các chủng kỹ thuật trao đổi chất, công nghệ phối hợp hai sóng của máy đục lỗ điện Venid cho thấy lợi thế. Chức năng đảo ngược phân cực được hỗ trợ của nó phù hợp với vật tư tiêu hao đa thông số kỹ thuật để đáp ứng nhu cầu phân phối các loại plasmid, DNA bộ gen và thậm chí RNA khác nhau, trở thành công cụ cốt lõi của nghiên cứu sinh học tổng hợp.

Máy đục lỗ điện toàn năng hai sóng Venid Gene Pulse X2 xác định lại hiệu quả và độ tin cậy của quá trình chuyển đổi tế bào gốc nhờ công nghệ hợp tác hai sóng mang tính cách mạng, hệ thống bảo vệ thông minh và thiết kế tương tác kỹ thuật số. Thiết bị này đã được kiểm chứng bởi hơn 100 doanh nghiệp dược phẩm sinh học và phòng thí nghiệm trọng điểm trong nước, cung cấp dịch vụ tối ưu hóa thông số chuyên biệt miễn phí và hỗ trợ kỹ thuật 7 × 24 giờ, giúp các nhà nghiên cứu đột phá nút thắt biểu hiện protein tái tổ hợp, đẩy nhanh chuyển hóa thành quả trong các lĩnh vực như liệu pháp gen, dược phẩm sinh học.

Tài liệu tham khảo

1- Vương Hồng Diễm; Vương Quế Cầm; Hác Tiểu Hạ. Xây dựng hệ thống biểu hiện prokaryote của proteoglycan lõi [J]; Thuốc và lâm sàng Trung Quốc; Kỳ 03 năm 2006

2- Kim Nguyên Xương; Lý Cảnh Bằng; Lý Hội Đông; Chu Kiến Hồng; Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện prokaryote của gen giải phóng gonadotropin tái tổ hợp [J]; Học bổng du học của khối Pháp ngữ (Programme de Bourses d'Excellence de l'Ambassade de France au Vietnam) ( Kỳ 02 năm 2006

3. Lý Hiểu Ba; Tiêu Kính; Phó Thụy; Hạ Tranh Minh; B. Biểu hiện prokaryote của glycoprotein virus và thiết lập các xét nghiệm ELISA [J]; Động vật thí nghiệm và y học so sánh; Kỳ 03 năm 2009

4- Tạ Hâm; Trần Mỹ Tình; Vương Dũng; Tưởng Quân Mai; Nhâm Minh Kiến; Thiết kế và thực hành các kỹ thuật biểu hiện protonucleic trong các thí nghiệm mở đại học [J] Tạp chí Khoa học và Giáo dục (Trung Tuần); 29 vấn đề năm 2020

 Động tác Balanced force technique ( Tạp chí Vi sinh học và Miễn dịch học Trung Quốc; Kỳ 04 năm 2004

6. Mã Linh Linh; Mã Hồng Mai; Ngô Sương; Vương Đông; Lý Dũng; Mã Thần Kiệt. Tằng Cẩn. Biểu hiện prokaryote của độc tố Clostridium perfringens β 1 và thiết lập phương pháp phát hiện ELISA gián tiếp cho kháng thể của nó [J]; Tạp chí Sinh học Trung Quốc; 12 vấn đề năm 2022

7. Tống Đào; Lý Vĩ Đào; Bành Thanh; Trần Hoành; Ni Tú Mị. Nhân bản và biểu hiện prokaryote [J] của gen protein vỏ virus lá đậu nành ở miền Nam; Khoa học nông nghiệp An Huy; Kỳ 13 năm 2013

8. Chung Ngọc Linh; Đại bang quốc; Đỗ Vĩ Vĩ; Trương Hoa Văn; Lý Thuần; Sử Hoài Bình; Biểu hiện prokaryote của lactoferrin dê sữa và chuẩn bị kháng thể đa dòng của nó [J]; 02 kỳ 2022

9. Vương Quỳnh Tú; Chu Tinh; Yếu tố hoại tử khối u liên quan đến apoptosis gây ra ligand protein [J] bằng phương pháp phân cấp trao đổi ion tinh chế biểu hiện prokaryote; Ngành dược Trung Quốc; Kỳ 10 năm 2013

10. Song Shuimei, ức chế hoạt động của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu [J] bởi thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu hòa tan được thể hiện bởi siêu nhân Shoucheng; Tạp chí Y học Trung Hoa; Kỳ 03 năm 2000