Nguyên tắc của phương pháp thử nghiệm

Các tế bào phát triển đến giai đoạn logarit muộn để chuẩn bị hệ thống treo tế bào nồng độ cao với các chất bảo vệ tế bào được thêm vào và các phần bằng nhau được chuyển vào ống đông lạnh, đóng băng từ từ.

Khi tế bào đông lạnh thêm chất bảo vệ vào môi trường, tức là nồng độ cuối cùng của glycerin hoặc dimethyl sulfoxide (DMSO) là 5,15%, có thể làm giảm điểm đóng băng của dung dịch, cộng với trong điều kiện đóng băng chậm, nước trong tế bào truyền ra, làm giảm sự hình thành tinh thể băng, do đó tránh tổn thương tế bào. Áp dụng phương pháp "đông lạnh nhanh tan" có thể đảm bảo sự sống sót của tế bào tốt hơn. Tốc độ đóng băng tiêu chuẩn bắt đầu từ -1 đến -2 ℃/phút, có thể tăng tốc khi nhiệt độ dưới -25 ℃, sau -80 ℃ có thể được đưa trực tiếp vào nitơ lỏng (-196 ℃).

Vật liệu thí nghiệm

tế bào

Thuốc thử, bộ dụng cụ

Loại trypsin BSS DMSO

Dụng cụ, vật tư tiêu hao

Ống hút ly tâm ống thủy tinh Ampoule rượu ánh sáng dây gạc túi men jar

Các bước thử nghiệm

1. Quan sát bằng mắt thường và kính hiển vi, đảm bảo tế bào đáp ứng tiêu chuẩn đông lạnh.

2. Làm cho tế bào phát triển đến giai đoạn cuối của sự phát triển logarit, nếu là tế bào dán tường, tiêu hóa bằng enzym tụy và tiến hành kỹ thuật tế bào. Nếu là tế bào sinh trưởng lơ lửng, tiến hành đếm tế bào và ly tâm.

Nồng độ của các tế bào lơ lửng là: 2 × 106~2 × 107 tế bào/ml.

4. Thêm bất kỳ tác nhân bảo vệ tế bào nào sau đây vào môi trường tăng trưởng để tạo ra dịch đông lạnh:

(a) cộng 10%~20% dimethyl sulfoxide (DMSO) hoặc (b) cộng 20%~30% glycerol.

5. Pha loãng đình chỉ tế bào theo tỷ lệ 1: 1 với dung dịch đông lạnh đến nồng độ tế bào khoảng 1 × 106~1 × 107/ml, tại thời điểm này nồng độ DMSO là 5% -10% (hoặc nồng độ glycerol là 10-15%). Không nên đặt ống lưu trữ đông lạnh trên băng, giảm thoái hóa tế bào. Hoạt động ở nhiệt độ phòng 30 phút là vô hại khi sử dụng DMSO và có lợi cho tế bào khi sử dụng glycerin.

6. Đóng gói hệ thống treo tế bào vào ống lưu trữ đông lạnh được đánh dấu trước, đậy nắp, thắt chặt, niêm phong, chú ý không quá chặt để tránh biến dạng xoắn ốc.

7. Kẹp ống lưu trữ đông lạnh trên dải nhôm, nạp vào thùng chứa hoặc sắp xếp chúng lỏng lẻo trong ngăn kéo.

8. Lưu trữ đông lạnh được đông lạnh với tốc độ 1 ℃/phút bằng một trong các phương pháp trên. Sử dụng phương pháp cách nhiệt, làm cho ống lưu trữ lạnh đạt đến -70 ℃, nếu nhiệt độ ban đầu là 20 ℃, cần 4~6h, nhưng tốt hơn -70 ℃ qua đêm.

9. Khi nhiệt độ của ống đông đạt đến -70 ℃ hoặc thấp hơn, trước khi chuyển nó ra khỏi -70 ℃ hoặc tủ đông có thể kiểm soát tốc độ đóng băng, hãy kiểm tra hồ sơ đóng băng để xác định vị trí thích hợp để lưu trữ ống đông trong bể nitơ lỏng.

10. Chuyển ống lưu trữ đông lạnh vào bể đông nitơ lỏng, không để nó chìm trong nitơ lỏng, đặt dải nhôm và ống giấy của ống lưu trữ đông lạnh dầu vào thùng lưu trữ được xác định trước hoặc đặt ống lưu trữ đông lạnh cá nhân vào ngăn kéo được xác định trước. Bước này phải được thực hiện nhanh chóng (<2 phút), vì các ống lưu trữ đông sẽ nóng lên với tốc độ 10 ° C/phút và các tế bào sẽ nhanh chóng xấu đi nếu nhiệt độ tăng trên -50 ° C.

Lưu ý

Dimethyl sulfoxide thâm nhập vào nhiều màng tổng hợp hoặc tự nhiên, bao gồm cả da và găng tay cao su. Do đó, nó nên được xử lý một cách thận trọng.

2. Găng tay bảo vệ và mặt nạ phải được sử dụng khi đặt ống lưu trữ đông lạnh vào nitơ lỏng.

khác1. Để duy trì tỷ lệ sống sót tối đa của tế bào, thông thường đều áp dụng phương pháp lưu trữ đông lạnh chậm.

2. Vật liệu đông lạnh càng gần bề mặt nitơ lỏng thì nhiệt độ càng thấp. Tốc độ đóng băng thấp tiêu chuẩn là -1 ℃~12 ℃/phút, khi nhiệt độ giảm xuống -25 ℃, tốc độ giảm có thể tăng lên -5~10 ℃/phút, khi đến -100 ℃, nó có thể nhanh chóng đóng băng vào nitơ lỏng. Vì vậy, để nắm bắt đúng tốc độ giảm lưu trữ đông lạnh vào nitơ lỏng, quá nhanh có thể ảnh hưởng đến sự xuất hiện của nước trong tế bào, quá chậm thì hình thành tinh thể thúc đẩy băng.

3. Người lưu trữ lần đầu tiên trong quá trình giảm lưu trữ đông lạnh, trước tiên nên sử dụng thanh gỗ mịn vào bể để phát hiện vị trí bề mặt chất lỏng, sau đó cần sử dụng phương pháp nhiệt kế và lưu trữ đông song song, để quan sát tốc độ giảm lưu trữ đông lạnh, lưu trữ đông lạnh và nitơ lỏng bề mặt khoảng cách và nhiệt độ ba mối quan hệ, khi đã nắm vững các tham số trên và kỹ thuật lưu trữ đông lạnh thành thạo, chỉ theo thời gian giảm và khoảng cách giảm có thể đạt được hiệu quả đông lạnh lý tưởng.

4. Các loại tế bào yêu cầu tốc độ đông lạnh cũng không giống nhau; Khả năng chịu đựng của tế bào biểu mô và nguyên bào sợi có thể lớn hơn, tế bào gốc tủy xương -2~3 ℃/phút là phù hợp; Tế bào phôi chịu được ít hơn, không nên quá nhanh. Tóm lại, ngay từ đầu, tốc độ giảm không thể vượt quá -10 ℃/phút.

5. những gì bảo vệ đại lý là thích hợp và bao nhiêu liều lượng, tùy thuộc vào tế bào, nuôi cấy tế bào đầu tiên với DMSO là tốt hơn, các tế bào nói chung có thể được sử dụng glycerin; Lượng dùng nhỏ hơn là tốt. Một số người tin rằng các tế bào biểu mô của da người được lưu trữ tốt trong 20-30% glycerin.

Về nguyên tắc, các tế bào có thể được lưu trữ trong nitơ lỏng trong nhiều năm, nhưng để phù hợp, sau khi đông lạnh trong một năm, nó nên được phục hồi và nuôi cấy một lần nữa, sau đó tiếp tục đông lạnh.