Alpha-melanocytic stimulatin (α-MSH) chịu trách nhiệm kích hoạt sản xuất melatonin, bảo vệ tự nhiên của cơ thể chống lại bức xạ cực tím (UV). Việc da tiếp xúc với tia cực tím thúc đẩy sản xuất alpha-MSH; Tuy nhiên, kích thích sinh tổng hợp melatonin trước khi tiếp xúc với tia cực tím có thể ngăn ngừa ung thư da do tia cực tím gây ra.

Xem xét rằng các dạng tự nhiên của alpha-MSH quá không ổn định trong cơ thể để được sử dụng như một tác nhân trị liệu, các chất tương tự khác nhau đã được tổng hợp, một trong số đó là MT-II (Hình 1), một peptide vòng có sức đề kháng cao và hiệu lực đặc biệt chống lại sự suy thoái enzyme.

Hình 1

　　Vì việc sản xuất MI-II có xu hướng cần được khuếch đại đến mức KG để đáp ứng nhu cầu lâm sàng, việc tối ưu hóa điều kiện quy trình ở quy mô phòng thí nghiệm phải tính đến khả năng khuếch đại của quy trình.

　　

　　Gyros Protein Technologies cung cấp máy tổng hợp polypeptide từ phòng thí nghiệm đến cấp độ thử nghiệm để giúp khuếch đại trơn tru từ giai đoạn phát triển quy trình đến sản xuất thương mại.

Trường hợp này sẽ thảo luận về việc tối ưu hóa và khuếch đại con đường tổng hợp hoàn toàn tự động, tức là tổng hợp các chuỗi tuyến tính và quá trình lactam hóa nhựa của peptide cuối cùng. Trong nỗ lực này, việc tối ưu hóa quá trình tổng hợp hàng loạt MT-II diễn ra trong ba giai đoạn:

　　1Tìm một chương trình bảo vệ thích hợp cho việc upcyclizing nhựa;

　　2Tối ưu hóa quy mô nhỏ các điều kiện tổng hợp và hoàn thành vòng lặp với PurePep Chorus, thiết bị hoạt động hoàn toàn tự động;

　　3Trên trình tổng hợp quy mô thí điểm PurePep Sonata+, MT-II tổng hợp được khuếch đại với các điều kiện được tối ưu hóa trước đó.

　　01Tìm giải pháp bảo vệ môi trường thích hợp cho nhựa

Cấu trúc của MT-II được hoàn thành sau khi cầu lactam được hình thành giữa aspartate và lysine, và những dư lượng này cần được loại bỏ có chọn lọc trước khi bước thượng lưu hóa nhựa. Do đó, lý tưởng là tìm các nhóm bảo vệ chuỗi bên có thể đi kèm với việc loại bỏ để giảm thiểu khó khăn trong việc khử bảo vệ. Trong giai đoạn đầu tiên của thí nghiệm này, MT-II được tổng hợp bằng cách sử dụng các nhóm bảo vệ chuỗi bên kết hợp khác nhau:

1Asp (ODmab) / Lys (ivDde)

2Asp (O-2-PhiPr) / Lys (Mtt)

3Asp (OAlly) / Lys (Alloc)

Nó có thể được loại bỏ đồng thời và chọn lọc bằng dung dịch DMF của 2% hydrazine, dung dịch DCM của 1% TFA và dung dịch DCM của palladium-tetraphenylphosphonium (Pd (PPh3)4) và phenylsilane (PhSiH), tương ứng. Độ tinh khiết thô của peptide cuối cùng được thể hiện trong Bảng 1.

Bảng 1 Độ tinh khiết peptide thô MT-II Tổng hợp nhóm bảo vệ chuỗi bên kết hợp khác nhau

Combo 2 đạt được độ tinh khiết peptide thô cao nhất khi so sánh các chế độ bảo vệ khác nhau. Tuy nhiên, Fmoc-Asp (O-2-PhiPr) -OH tương đối đắt và sẽ làm tăng chi phí sản xuất sau này. Sự kết hợp 1 có độ tinh khiết peptide thô thấp nhất, do hiệu quả khử bảo vệ kém của ODmab và ivDde bằng cách xử lý hydrazine 2%. Ngoài ra, mặc dù Combo 3 cho thấy độ tinh khiết thô thấp hơn nhiều so với Combo 2, điều này đã được phân tích chủ yếu liên quan đến sự hình thành asparagine. Bằng cách giảm thiểu phản ứng phụ này, độ tinh khiết peptide thô có thể được cải thiện đáng kể. Do đó, Asp (OAlly)/Lys (Alloc) được chọn làm monome MT-II tổng hợp và tối ưu hóa tiếp theo.

　　02 Tối ưu hóa điều kiện ngưng tụ quy mô nhỏ

Chúng tôi bắt đầu bằng cách xem xét DIC và OxymaPure cho các bước ghép nối mà không cần kích hoạt trước (4) và kích hoạt trước trong 5 phút (5). Như với Combo 3, các phương pháp này dẫn đến giảm đáng kể độ tinh khiết peptide thô do sự hình thành asparagine (Bảng 2). Do đó, MT-II được tổng hợp theo cách từng bước: tổng hợp peptide thành His (His-D-Phe-Arg-Trp-Lys (Alloc) -Resin) và ngưng tụ Asp (OAlly) với HCTU/NMM (6) hoặc DIC/OxymaPure (7). Sau khi ngưng tụ Asp (OAlly), microcut được thực hiện, trong đó không có sự hình thành aspartimide nào được quan sát thấy. Độ tinh khiết thô của các mảnh này là 88,9%.

Bảng 2 Độ tinh khiết của MT-II tổng hợp trong các điều kiện khác nhau

　　Tổng hợp các peptide tuyến tính

Tuyến tính MT-II được tổng hợp trên PurePep Chorus ở quy mô 100 μmol trên nhựa Rink Amide MBHA (0,35 mmol/g). Trước khi tổng hợp, nhựa được hòa tan trong DMF trong 2 × 10 phút. Bước khử bảo vệ được thực hiện trong 2 × 5 phút với dung dịch 20% piperidine DMF và ngưng tụ với 5 tương đương AA, 5 tương đương DIC và 5 tương đương OxymaPure DMF trong dung dịch (không preactivation-4, hoặc 5 phút preactivation-5), kéo dài 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đối với các phân đoạn 7 và 9, Asp (OAlly) và Nle ngưng tụ trong cùng điều kiện như 5. Đối với phân đoạn 6 và 8, Asp (OAlly) và Nle được ngưng tụ trong DMF với HCTU (tương đương 5) và NMM (tương đương 10) ở nhiệt độ phòng với thời gian kích hoạt trước là 5 phút và thời gian ngưng tụ đơn là 30 phút. Terminamine của MT-II được acetyl hóa ở nhiệt độ phòng với dung dịch DMF 10% Ac2O trong 30 phút.

Loại bỏ chọn lọc các nhóm bảo vệ chuỗi bên Asp và Lys: khử bảo vệ của Asp (OAlly) và Lys (Alloc) được rửa hai lần ở nhiệt độ phòng với Pd tương đương 0,2 (PPh3) 4 trong dung dịch DCM 24 PhSiH tương đương trong 60 phút, sau đó 3 lần với DCM và DMC mỗi lần.

　　Upcyclizing nhựa

Ở nhiệt độ phòng, tái tạo nhựa trong dung dịch DMF với pixime (5 tương đương) và dipea (5 tương đương) trong 60 phút.

　　Cắt

Nhựa được rửa 3 lần với DMF, 6 lần với DCM và sau đó sấy khô trong 20 phút. Hỗn hợp TFA/EDT/H2O/TIS (94: 2,5: 2,5: 1) với mỗi lần cắt được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 60 phút trước khi kết tủa trong ether.

　　03在 PurePep Sonata + 上放大 MT-II 的合成

Sau khi tổng hợp được tối ưu hóa ở quy mô nhỏ trên PurePep Chorus, phương án 8 là tối ưu. MT-II tổng hợp trên quy mô lớn (5 mmol) trên PurePep Sonata+.

Tùy thuộc vào phương pháp và điều kiện tổng hợp của sơ đồ 8, MT-II được tổng hợp trên PurePep Sonata+lên đến Asp (OAlly) [Fmoc-Asp (OAlly) -His-D-Phe-Arg-Trp-Lys (Alloc) -Resin], sau đó nhóm bảo vệ chuỗi bên được loại bỏ có chọn lọc để sử dụng trong quá trình thượng vòng nhựa tiếp theo. Sau khi vòng hóa, trình tự được hoàn thành bằng cách thêm Nle và N-terminal acetyl hóa. Theo chiến lược này, MT-II đạt được độ tinh khiết thô 80,2%, tương đương với độ tinh khiết peptide thô 0,1 mmol được tổng hợp trên PurePep Chorus.

　　kết luận

● Máy tổng hợp hoàn toàn tự động đa kênh PurePep Chorus cho phép tổng hợp MT-II quy mô nhỏ và khám phá và tối ưu hóa các điều kiện tổng hợp khác nhau, sau đó đưa các điều kiện tổng hợp tối ưu lên PurePep Sonata+với quy mô tổng hợp được khuếch đại từ 100 µmol đến 5 mmol (tăng 50 lần) và đạt được độ tinh khiết peptide thô gần như nhất quán 80,1%.

●Nghiên cứu này được hưởng lợi từ tính linh hoạt của PurePep Chorus, MT-II là tổng hợp hoàn toàn tự động từ đầu đến cuối: từ polypeptide tuyến tính đến khử chuỗi bên chọn lọc và tăng vòng lặp nhựa, các điều kiện ngưng tụ khác nhau được lựa chọn cho mỗi bước và mẫu chiết xuất microcut trực tuyến có thể được thử nghiệm trong quá trình tổng hợp để điều chỉnh các điều kiện theo kết quả thí nghiệm. Quá trình chuyển đổi suôn sẻ trên PurePep Chorus được phóng to lên PurePep Sonata+và nhận được kết quả tương tự.