Sự phát triển của vắc-xin, từ nghiên cứu và phát triển đến nghiên cứu tiền lâm sàng sớm đến sản xuất thương mại, thử nghiệm và phát hành hàng loạt, liên quan đến rất nhiều phân tích và thử nghiệm để đảm bảo tính hiệu quả và an toàn của sản phẩm vắc-xin. Phân tích sinh học trong quá trình phát triển vắc-xin phải đối mặt với những thách thức về ma trận mẫu, loại chất phân tích và hiệu quả của quy trình làm việc, chẳng hạn như các mẫu vắc-xin được sử dụng để phân tích rất khác nhau và phạm vi phân tích rộng, bao gồm polysaccharide, protein và polypeptide, tất cả đều phải được phát hiện trong các ma trận khác nhau. Ngoài ra, các loại vắc-xin thế hệ mới liên quan đến số lượng kháng nguyên ngày càng tăng, chẳng hạn như vắc-xin HPV (human papillomavirus) có nhiều loại như hóa trị hai, hóa trị bốn và hóa trị chín, do đó làm tăng đáng kể sự phức tạp của việc phát hiện. Phương pháp phân tích miễn dịch thường được sử dụng để xác định độ chuẩn, độ tinh khiết và hiệu quả của vắc-xin, cũng như phản ứng miễn dịch của chúng ở động vật và con người, v.v., và phân tích miễn dịch ELISA dựa trên tấm xốp đã trở thành một trong những kỹ thuật tiêu chuẩn vàng trong phân tích sinh học vắc-xin, bao gồm cả thang kháng nguyên định lượng, đánh giá mức độ tạp chất và theo dõi độ chuẩn độ và tính miễn dịch trong phát triển vắc-xin, v.v. Tuy nhiên, lịch trình dự án ngày càng cấp bách đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu bắt đầu tìm kiếm những cải tiến trong hiệu suất phân tích miễn dịch của vắc-xin, bao gồm:

Sử dụng một lượng nhỏ hơn các tác nhân có giá trị như các phân tử ứng cử viên vắc-xin, cũng như các mẫu từ động vật thí nghiệm nhỏ

Phương pháp phát hiện có thể xử lý thuận tiện các mẫu huyết thanh và huyết tương, các phụ gia nhôm và các phụ gia sữa dầu

Giảm thời gian thực hành

Giảm thời gian phát triển phương pháp phát hiện

Gyrolab ® Hệ thống cung cấp một giải pháp cho những nhu cầu này và cung cấp nhiều lợi ích bổ sung trong việc phát triển vắc-xin. Nền tảng mở của Gyrolab hỗ trợ phát triển phát hiện nhanh chóng các chất phân tích, loại mẫu và công thức khác nhau và cung cấp bộ dụng cụ sẵn sàng sử dụng cho nhiều ứng dụng. Gyrolab trong Bioaffy ™ Kiểm tra miễn dịch nâng cấp nano được thực hiện trong đĩa CD vi lưu, giảm thiểu sự can thiệp từ nhiều chất nền và tiêu thụ mẫu và thuốc thử rất nhỏ, có thể đáp ứng nhu cầu của vắc-xin thế hệ mới nhất và thử nghiệm trên động vật thí nghiệm nhỏ; Chế độ thông lượng và tự động hóa cao thực hiện phân tích song song nhiều phân tích giúp giảm đáng kể thời gian thực hành và có thể cung cấp dữ liệu nhanh chóng, đáp ứng lịch trình dự án đầy thách thức và ra quyết định nhanh hơn. Gyrolab Software Workstation đáp ứng 21 CFR Phần 11 và phát triển các phương pháp thử nghiệm và dữ liệu để đáp ứng các yêu cầu của môi trường pháp lý và chuyển giao trơn tru giữa các nhà máy dược phẩm và CRO.

　　Bài viết này trình bày một số trường hợp ứng dụng sử dụng hệ thống Gyrolab để cải thiện hiệu suất và hiệu quả nghiên cứu và phát triển vắc-xin để minh họa những lợi ích của hệ thống Gyrolab trong sử dụng thực tế.

Ví dụ 1:Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng nguyên trong huyết thanh trong vòng 1,5 giờ

Phát hiện số lượng và chất lượng kháng thể được tạo ra bởi các tế bào B bộ nhớ (MBC) của các đối tượng được tiêm chủng là chìa khóa để hiểu cách tạo ra các kháng thể bảo vệ suốt đời. Tần suất tương đối của các tế bào B nhớ đặc hiệu kháng nguyên máu ngoại vi thường được xác định bằng phương pháp pha loãng giới hạn liên tục (sLDA) và nuôi cấy tế bào phân tích ELISA, nhưng phương pháp này tốn thời gian và tốn nhiều vật liệu thí nghiệm, do đó, các nhà nghiên cứu phát triển vắc-xin và chẩn đoán của Novartis đã chuyển xét nghiệm miễn dịch ELISA sang hệ thống Gyrolab để tăng sản lượng. Mục tiêu của nghiên cứu là tiêm kháng nguyên Neisseria (Neisseria) cho chuột sau khi kết hợp với ba chất bổ trợ để xác định phân nhóm IgG được sản xuất bởi các tế bào B bộ nhớ của chuột bằng xét nghiệm miễn dịch. Các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm hai hình thức phát hiện:

　　Kiểm tra trực tiếp (Direct Assay)

Để đánh giá: ① Khả năng kháng nguyên biotin hóa liên kết với cột streptomycin ái lực và bắt IgG cụ thể trong đĩa CD Micro-Flux Gyrolab Bioaffy; ② Phát hiện độ nhạy của kháng thể đặc hiệu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào; ③ Đánh giá ái lực của kháng thể liên kết với kháng nguyên cụ thể thông qua đường cong liên kết trong Gyrolab Viewer.

　　Kiểm tra ngược (Reverse Assay)

Được sử dụng để đánh giá khả năng phát hiện kháng nguyên đánh dấu huỳnh quang của Alexa để phát hiện IgG cụ thể liên kết với cột ái lực CD.

Thử nghiệm trực tiếp

Hình 1. Xét nghiệm Gyrolab và ELISA đã xác định các mẫu dương tính và âm tính giống nhau trong dịch thượng thanh nuôi cấy tế bào B của chuột được thử nghiệm được tiêm Neisseria. Trục Y là chuẩn độ kháng thể được phát hiện bởi Gyrolab và các mẫu dương tính được ELISA xác định được đánh dấu bằng hộp màu xanh lá cây.

Xét nghiệm trực tiếp Gyrolab có thể phát hiện đồng thời các kháng thể thuộc các phân nhóm IgG khác nhau trong một vài microlit mẫu.

Xét nghiệm kháng thể đặc hiệu kháng nguyên trên hệ thống Gyrolab có nhiều ưu điểm so với ELISA, chỉ cần một vài microlit mẫu để phân tích chất lượng của phản ứng kháng thể, số lượng tương đối của phân nhóm IgG.

Trường hợp 2:Sàng lọc tác nhân - So sánh lô vắc-xin để phát hành thử nghiệm

Phân tích sinh học của vắc-xin đa trị ngày càng phức tạp và đòi hỏi phải phát triển một số lượng lớn các xét nghiệm. Bởi vì vắc-xin đa trị chứa nhiều kháng nguyên và các xét nghiệm phát hành phải được phát triển cho từng thành phần kháng nguyên để đảm bảo liều lượng và hiệu lực, số lượng xét nghiệm trên mỗi sản phẩm được nhân với số lượng kháng nguyên. Nhóm phát triển phân tích vắc-xin của Merck đã phát triển một xét nghiệm Gyrolab rất linh hoạt có thể giảm thiểu sự phát triển của các phương pháp thử nghiệm vắc-xin đa giá trị và tiêu thụ thuốc thử (như các kháng thể phát hiện được dán nhãn, v.v.). Phương pháp này dựa trên kháng thể chống chuột IgG từ dê biotin được gắn vào cột ái lực streptomyces của đĩa CD Gyrolab Bioaffy, thêm kháng thể bắt giữ đặc hiệu phân tích (như chuột alpha-PS mAb) trước khi thêm mẫu, sau đó phát hiện phân tích bị bắt bằng kháng thể đặc hiệu phân tích thứ hai (như thỏ alpha-PS pAb) và cuối cùng là Alexa Fluor. ® 647 Các kháng thể chống thỏ được đánh dấu của lừa được kiểm tra huỳnh quang (Hình 3). Hình thức phát hiện "bánh sandwich kép" 5 lớp này không cần phải dán nhãn thuốc thử nhắm vào một chất phân tích cụ thể và thuốc thử đặc hiệu phân tích có thể dễ dàng được thay thế, vì vậy chỉ cần phát triển tối thiểu để áp dụng cho việc phát hiện các loại vắc-xin polysaccharide và protein đa trị và sự khác biệt giữa các đợt kháng huyết thanh.

Hình 3. Hình thức phát hiện Gyrolab "Double Sandwich" 5 lớp. PS: Phân tích polysaccharide

Xét nghiệm Gyrolab được sử dụng để so sánh hai lô kháng huyết thanh chống lại ba xét nghiệm kháng nguyên. Sử dụng mô-đun phần mềm Gyrolab Viewer cho phép hình dung phản ứng kết hợp của từng điểm dữ liệu trên cột Affinity trong microchannel CD, cho phép dữ liệu so sánh với đường cong hiệu lực tốn nhiều thời gian hơn (Hình 4).

Hình 4. Panel A: So sánh các lô kháng huyết thanh chống lại các nguyên tố A, B và C sử dụng dữ liệu cường độ huỳnh quang (trái) và đường cong phản ứng (phải). Panel B: Hình ảnh đường cong cường độ liên kết của Gyrolab Viewer của kháng nguyên B cho thấy cường độ huỳnh quang thấp hơn trên cột của lô mới và tăng độ trễ đỉnh, cho thấy mối quan hệ kháng thể thấp hơn so với lô cũ.

Trong khi cả hai lô đều hoạt động tương tự như nhau chống lại A ban đầu, các lô cũ hoạt động tốt hơn so với B ban đầu, với diện tích đỉnh lớn hơn để kết hợp quang phổ trong Trình xem Gyrolab và tỷ lệ tín hiệu-noise cao hơn khi chuẩn độ. Các lô mới cho thấy sự kéo dài huỳnh quang rõ rệt trên cột, cho thấy ái lực thấp với kháng nguyên. Đối với kháng nguyên C, thanh lọc kháng máu của cả hai lô cho thấy hiện tượng kéo dài đáng chú ý, và các lô cũ cho thấy nhiều vết kéo dài hơn. Khi chuẩn độ, các lô cũ có nền cao hơn và tiếng ồn thấp hơn. Do đó, sự kết hợp của quang phổ kết hợp trực quan, đường cong phản ứng và tỷ lệ tín hiệu-tiếng ồn của Gyrolab Viewer cung cấp ý kiến có giá trị để hiểu các lô kháng huyết thanh.

Nhóm nghiên cứu của Merck kết luận rằng hệ thống Gyrolab cung cấp dữ liệu thống kê và đồ họa có giá trị, khi được đánh giá cùng nhau, phù hợp với dữ liệu phát hiện dựa trên tấm xốp, với những lợi ích bổ sung như thời gian quay vòng nhanh, thông lượng cao và khả năng hình dung sức mạnh kết hợp.

Trường hợp 3:Phạm vi động định lượng chuẩn độ kháng nguyên mở rộng đến 4 logs

Các công ty phát triển vắc-xin cần mở rộng phạm vi động của xét nghiệm miễn dịch để đo các kháng nguyên glycoprotein hấp thụ trên các phụ gia nhôm. Các nhà nghiên cứu đã chuyển ELISA sang hệ thống Gyrolab, mở rộng phạm vi động từ 5-300 mIU/mL đến~0,6-40.000 mIU/mL, với phát hiện Gyrolab mở rộng cả giới hạn trên và giới hạn dưới.

Hình 5. Gyrolab cung cấp một phương pháp phát hiện mạnh mẽ mở rộng đáng kể dải động khi đo chuẩn độ kháng nguyên.

Trường hợp 4:Thử nghiệm hiệu lực vắc-xin để hỗ trợ phát triển công thức

Đánh giá tính nhất quán của hiệu quả giữa các lô là một phần quan trọng trong kiểm soát chất lượng vắc-xin. Thử nghiệm hiệu lực có thể được sử dụng trong nghiên cứu ổn định, xác minh và tối ưu hóa quá trình lên men và tinh chế, so sánh các cơ sở cũ và mới và để đánh giá hiệu quả của các thay đổi công thức hoặc bổ trợ.

Merck của Mỹ đã so sánh hiệu suất của hệ thống Gyrolab với thử nghiệm Luminex trên chuột. Nghiên cứu liên quan đến khả năng miễn dịch ở chuột, pha loãng các mẫu kháng nguyên bình thường thành 6-12 liều nồng độ. Liều hiệu quả (ED50) được xác định dựa trên liều tối đa của 50% chuyển đổi huyết thanh chuột trong mỗi nhóm dùng thuốc, đòi hỏi tối đa 220 mẫu huyết thanh chuột để có được một giá trị ED50, vì vậy công việc tẻ nhạt này đòi hỏi một lượng lớn các mẫu nhỏ. Thử nghiệm Gyrolab đã được chứng minh là đáng tin cậy và mạnh mẽ, với độ nhạy và khả năng tái tạo (CV<10%) tương đương với thử nghiệm Luminex (R2=0,97), nhưng thời gian hoạt động ngắn hơn và thời gian quay vòng nhanh hơn.

Hình 6. Phát hiện Gyrolab có độ lặp lại cao, CV<10%

Hình 7. Xét nghiệm miễn dịch của Gyrolab và Luminex cho kết quả so sánh