“

　　Tối ưu hóa nhanh các điều kiện tổng hợp PNA với PurePep Chorus đa kênh

Peptide nucleic acid (PNA) là một chất tương tự DNA với một bộ xương polypeptide và có nhiều tính chất vật lý hóa học. Bộ xương chuỗi chính của PNA được hình thành từ sự kết nối của N (2-aminoethyl) -glycine với nucleic acid base thông qua một nhóm carbonyl methylene.

Hình 1: Sơ đồ cấu trúc của axit peptide nucleic và liên kết với DNA

Các chất tương tự axit nucleic không ion peptide, vì PNA không mang điện tích âm, không có lực đẩy tĩnh điện giữa DNA và RNA, do đó, sự ổn định và tính đặc hiệu của liên kết được cải thiện rất nhiều, khả năng lai với các phân tử DNA hoặc RNA vượt trội hơn nhiều so với DNA/DNA hoặc DNA/RNA, thể hiện ở sự ổn định lai cao, khả năng nhận dạng trình tự đặc hiệu tuyệt vời, không bị thủy phân bởi enzyme nucleic và protease.

PNAs có thể ức chế biểu hiện gen bằng cách bổ sung liên kết RNA. Và trong các điều kiện cụ thể, biểu hiện gen cũng có thể được thúc đẩy bằng cách kết hợp cơ chế xâm nhập chuỗi với trình tự chuỗi kép DNA. Dựa trên các đặc điểm thuận lợi trên, PNA đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trong thập kỷ qua, và ái lực và tính đặc hiệu cao đã làm cho chúng trở thành công cụ mạnh mẽ không chỉ trong điều trị mà còn trong các ứng dụng chẩn đoán.

Khi nghiên cứu cơ bản của PNA tiếp tục đi sâu và các công nghệ mới tiếp tục xuất hiện, PNA sẽ cho thấy hiệu suất tốt hơn và triển vọng ứng dụng rộng lớn hơn.

　　Thách thức hiện tại

Do sự trùng hợp dễ xảy ra trong quá trình tổng hợp và có nhiều phản ứng phụ trong quá trình khử bảo vệ, quá trình tổng hợp PNAs là một thách thức lớn. Đối với các vấn đề dễ trùng hợp, chiến lược thông thường là sử dụng quá liều thuốc thử trong phản ứng ngưng tụ. Tuy nhiên, thuốc thử monomer PNA để bảo vệ N-end để tổng hợp có giá tương đối cao và phương pháp này không được sử dụng rộng rãi. Do đó, các quy trình tổng hợp tương đối hiệu quả về chi phí phải được phát triển để giúp PNAs thương mại hóa thành công.

　　Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp trên PurePep Chorus

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ chỉ ra cách tối ưu hóa nhanh chóng các điều kiện tổng hợp cho PNA trên máy tổng hợp tự động PurePep Chorus.

PNA 1 sẽ được sử dụng để tham khảo trình tự để kiểm tra các thông số tổng hợp khác nhau, chẳng hạn như hệ số dư, thời gian phản ứng, cũng như nhiệt độ của các monome PNA. Các điều kiện có độ tinh khiết cao nhất của PNA 1 sẽ được sử dụng để tổng hợp 5 chuỗi khác có độ dài và hàm lượng purine khác nhau (adenine và guanine) (xem Bảng 1). Độ tinh khiết là một yếu tố quan trọng để kiểm tra tổng hợp, và do sức đề kháng vị trí không gian lớn của các monome PNA, nó dễ gây ra phản ứng ngưng tụ không hoàn toàn dẫn đến độ tinh khiết thấp.

Bảng 1: Thông tin chuỗi PNA liên quan đến trường hợp này

PNA 1 được tổng hợp bằng máy tổng hợp polypeptide PurePep Chorus với tương đương 25 μmol, sử dụng nhựa Rink Amide MBHA với độ thay thế 0,27 mmol/g và tuân theo chế độ bảo vệ trực giao Fmoc/tBu. Việc khử bảo vệ nhóm Fmoc trên nhựa sử dụng dung dịch DMF piperidine 20%, phản ứng trong 5 phút × 2 lần ở nhiệt độ phòng; Phản ứng ngưng tụ sử dụng hệ thống của HCTU và NMM, chi tiết cụ thể của phản ứng được trình bày trong Bảng 2. Hoạt động niêm phong được thực hiện sau khi kết thúc phản ứng ngưng tụ, sử dụng dung dịch DMF anhydrit axetic 10%, phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Khi quá trình khử bảo vệ cuối cùng kết thúc, nhựa được đặt trong chất lỏng cắt (TFA: TIS: H2O=95: 2.5: 2.5) và phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ.

Các thao tác trên có thể thiết lập Protocol khác nhau trên phần mềm trên Chorus theo các điều kiện cần thiết, phần mềm tự động tính toán lượng thuốc thử cần thiết, thiết bị chạy tự động, tiết kiệm nhân công hơn và đảm bảo rằng chương trình thử nghiệm được thực hiện nghiêm ngặt.

Bảng 2 Nghiên cứu điều kiện ngưng tụ

Từ phân tích dữ liệu trong Bảng 2, chúng ta có thể thấy rằng khi số lượng phản ứng tương đương của PNA gấp 10 lần, độ tinh khiết của sản phẩm thô đạt 81%. Tuy nhiên, dựa trên giá cao của nguyên liệu tổng hợp Fmoc-PNA monomer, thiết kế trên không dễ chấp nhận. Giảm hệ số tương đương phản ứng của PNA xuống 4 lần và độ tinh khiết của sản phẩm thô xuống 72%. Tại thời điểm này, hệ số tương đương phản ứng duy trì PNA là 4 lần, tăng nhiệt độ phản ứng lên 45 ° C và giảm thời gian ngưng tụ xuống còn 5 phút, độ tinh khiết của sản phẩm thô tiếp tục giảm xuống 61%. Bởi vậy có thể thấy được, đối với phản ứng khép kín mà nói thời gian phản ứng 5 phút quá ngắn. Lúc này các điều kiện khác không thay đổi, chỉ riêng thời gian phản ứng tăng lên 10 phút (thí nghiệm D), độ tinh khiết của peptide thô đạt 82%, tương đương với kết quả của thí nghiệm A. Thí nghiệm E được sử dụng để khảo sát thêm các điều kiện của phản ứng, hệ số tương đương của phản ứng được điều chỉnh thành 2 và hai phản ứng mẫu đã được thực hiện. Tổng lượng nguyên liệu phản ứng tương tự được sử dụng và trong cùng một thời gian ngưng tụ, độ tinh khiết của sản phẩm thô tăng 5%.

Chúng tôi xác định điều kiện tổng hợp dựa trên giá trị cao nhất của độ tinh khiết của sản phẩm PNA 1 và một số trình tự còn lại sẽ được tổng hợp theo cách tương tự như PNA 1 (tức là phương pháp E). Kết quả được hiển thị trong Bảng 3:

B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)

Độ tinh khiết thô của 5 sản phẩm sau khi tổng hợp PNA ở trên dao động từ 66-91%, kết quả đạt yêu cầu đối với axit peptide nucleic. Điều thú vị là các sản phẩm PNA có hàm lượng purin cao hơn có độ tinh khiết cao hơn.

Hình 2: 5 sắc ký được thu thập bởi các sản phẩm PNA ở bước sóng 210nm bằng hệ thống UPLC-UV. Hệ thống UPLC là Water H-class UPLC/ESI-MS và cột sắc ký C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm). Giai đoạn dòng chảy là 0,1% TFA trong nước (A) trộn với dung dịch acetonitrile (B).

　　tổng kết

Trong tài liệu ứng dụng này, chúng tôi đã thảo luận chi tiết về cách tối ưu hóa tổng hợp PNA bằng cách sử dụng hệ thống PurePep Chorus. Ban đầu, chúng tôi đã sử dụng PNA 10 lần tương đương với phản ứng ngưng tụ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để thu được sản phẩm thô có độ tinh khiết đạt 81%. Chúng tôi làm việc để giảm lượng chất phản ứng và giảm thiểu tác động của nó đối với độ tinh khiết thô để làm cho phản ứng này kinh tế hơn, bền vững hơn và phù hợp hơn với các yêu cầu của hóa học xanh. Cuối cùng chúng tôi đã phát triển ra phương pháp vừa giảm lượng chất phản ứng, độ tinh khiết vừa cao. Bằng cách sử dụng 2 lần ngưng tụ, mỗi lần lấy mẫu với 2 lần tương đương phản ứng và phản ứng trong 5 phút ở 45 ℃, độ tinh khiết thô của PNA 1 có thể tăng từ 81% lên 87%. Cuối cùng, phương pháp này được áp dụng cho việc tổng hợp 5 PNA khác.

Đối với các axit peptide nucleic có độ dài khác nhau và hàm lượng purine khác nhau, phương pháp này đều có thể thu được sản phẩm rất tốt. Máy tổng hợp polypeptide PurePep Chorus là một công cụ tuyệt vời cho công việc này, vì sơ đồ tổng hợp có thể được điều chỉnh linh hoạt theo yêu cầu; Ví dụ, thay đổi hệ số tương đương phản ứng, số lần lặp lại, nhiệt độ và thời gian. Đồng thời, các tính năng tính toán tự động của các công cụ và phần mềm tự động giúp giảm hoạt động của con người, giảm rủi ro lỗi và các điều kiện tổng hợp được tối ưu hóa có thể dễ dàng áp dụng cho các tổng hợp PNA khác.