Dịch vụ chuẩn bị kháng thể đa dòng

Dịch vụ chuẩn bị kháng thể đa dòng

Quy trình chuẩn bị chung của polyantin: * Chuẩn bị kháng nguyên -+Miễn dịch thỏ - → Phát hiện hiệu lực và kết thúc -+Tinh chế ái lực kháng thể -+Tập trung và bảo quản kháng thể.

Các bước thí nghiệm cụ thể như sau:

1 Chuẩn bị thỏ

Chọn hai con thỏ trắng lớn khỏe mạnh cỡ 6 tuần (khoảng 2Kg) để thích nghi với môi trường sống mới, ổn định ít nhất vài ngày trước khi tiến hành lấy máu, lấy máu trước (để tham khảo âm tính)

1.1 Đặt thỏ cẩn thận vào khung cố định để thỏ bình tĩnh;

1.2 Cẩn thận cạo lông trên tai thỏ để các mạch máu có thể nhìn thấy rõ ràng (cũng không cạo);

1.3 Nếu cần thiết, có thể sử dụng các quả bóng bông nhỏ để bôi lên các vị trí của mạch máu với rượu để làm cho các mạch máu mở rộng;

1.4 Lấy khoảng 10 ml máu (khoảng 5 ml huyết thanh) từ tĩnh mạch tai bằng ống tiêm;

1,5 Cẩn thận rút kim ra, ấn thích hợp vết thương để tránh chảy máu, sau đó dùng bông gòn cồn khử trùng vết thương;

1.6 Đặt máu thu thập ở 37 C trong 30 phút bất hoạt, sau đó ở 4'C qua đêm để máu đông giải phóng huyết thanh;

1.7 sẽ đông máu tốt trong 10 phút ly tâm 10000r/phút; H. Thu thập thanh lọc, tức là huyết thanh.

Miễn dịch thỏ

2.1 Tiêm hai con thỏ kháng nguyên là 1 ml, dung dịch đệm kháng nguyên phải không chứa thuốc thử hóa học có hại cho thỏ, mỗi con thỏ miễn dịch ban đầu 400 ug kháng nguyên thích hợp hơn, cũng có thể được giảm thích hợp để có được kết quả tốt hơn, miễn dịch tiếp theo mỗi lần là 100 ug.

2.2 Trộn đầy đủ 1 m tá dược Buddha * với kháng nguyên 1m đã chuẩn bị, có màu trắng sữa; .

2.3 Cẩn thận lấy thỏ ra khỏi lồng, dệt thỏ miễn dịch 4 bộ phận (lưng và chân đều có thể), mỗi bộ phận 250ul, kim ở góc 45 độ chèn 1-2cm dưới da, sau khi tiêm ở lại vài giây để ngăn chặn dòng kháng nguyên.

Chu kỳ dịch thỏ là 20 ngày, sau khi miễn dịch xong 7 - 10 ngày lấy máu (bao gồm lấy máu giữa chừng và lấy máu cuối cùng), tổng cộng miễn dịch 4 - 5 lần.

3. Kiểm tra hiệu quả

3.1 2 tham chiếu âm tính là huyết thanh máu lấy trước, tất cả đều pha loãng ở nồng độ 1 kháng ban đầu (pha loãng khép kín); Tham chiếu dương tính là trước đây

Huyết thanh dương tính

3.2 Thêm kháng nguyên 100ul, 1ug/m cho mỗi lỗ trong 96 lỗ, qua đêm ở 49C hoặc ủ ở 37 ° C trong 2 giờ.

3.3 Đổ dung dịch kháng nguyên, mỗi lỗ thêm 200u dung dịch khép kín, 49C qua đêm hoặc 379C ủ trong 2 giờ.

3,4 Đổ chất lỏng kín, vỗ vào giấy hấp thụ cố gắng hút khô chất lỏng còn sót lại, dùng chất tẩy rửa ba lần mỗi lần cố gắng vỗ khô chất lỏng còn sót lại, nếu muốn đặt một thời gian, 37 độ C sấy khô và dùng túi niêm phong niêm phong lưu trữ tốt hơn 20 độ C.

3,5. Lấy gói được 96 lỗ.第---Lỗ được thêm vào dung dịch tham chiếu âm tính 100ul, lỗ thứ hai được thêm vào dung dịch tham chiếu dương tính 100ul, lỗ thứ ba được thêm vào kháng huyết thanh đang chờ xét nghiệm 1:500, các lỗ tiếp theo được pha loãng theo tỷ lệ gấp đôi trên cơ sở này, ủ ở 37 ° C trong 1 giờ.

3,6 Đổ chất lỏng ra, dùng chất tẩy rửa rửa ba lần, vỗ khô. 100 u HRP đánh dấu chuột kháng thỏ lgG (pha loãng 1: 2000) được thêm vào mỗi lỗ và ủ ở 37 ° C trong 45 phút.

3,7 Đổ chất lỏng, dùng chất tẩy rửa rửa ba lần, vỗ khô. Thêm 100u TMB substrate (TMB đơn thành phần Sigma) 37 ° C ủ trong 5-20 phút (tùy thuộc vào độ sâu màu sắc để xác định thời gian tạo màu).

3.8 Kết thúc 50u (2N H2SO4) được thêm vào mỗi lỗ để đọc giá trị hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450nm trên máy đo enzyme.

Sau khi xét nghiệm hiệu lực kháng thể đạt trên 1 triệu có thể tiến hành lấy máu cuối cùng cho thỏ.

Thanh lọc kháng thể

4. Affinity của kháng thể - Chuẩn bị cột Affinity

4.1 Một gel agarose được gọi là 1mg CNBr-Sepherose 4B được thêm vào axit clohydric 2mmol/L, và 4'C qua đêm cho phép nó hòa tan hoàn toàn để có được một gel 3 m.

4.2 Chuyển gel vào cột tinh khiết, rửa môi trường axit clohydric khoảng 20ml 2mmol/L 3 lần.

4.3 Rửa phương tiện truyền thông với bộ đệm ghép nối - thứ cấp, bởi vì nhóm kích hoạt dễ bị thủy phân dưới giá trị PH của bộ đệm ghép nối, vì vậy bước nàyLàm trong vài phút.

4.4 Thêm kháng nguyên 5-10mg hòa tan trong 5ml đệm kết nối vào gel

4.5 Lắc nhẹ nhàng ở nhiệt độ phòng trong 2-4 giờ hoặc 4'C qua đêm, nếu cần xác định hiệu quả kết hợp, lấy một lượng nhỏ dung dịch để đo sau khi kết thúc bước này. Rửa phương tiện truyền thông một lần với 20ml đệm kết nối.

4.6 Thêm dung dịch BSA 15m1 1% để ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc 4'C qua đêm.

4.7 Rửa môi trường bằng dung dịch đệm phosphate hơn 3 lần, mỗi lần trên 15m h.

4.8 Giai đoạn rắn kháng nguyên hoàn thành và có thể được sử dụng để tinh chế.

4.9 Nếu không sử dụng ngay lập tức hoặc sau khi sử dụng, hãy lưu trữ 20% ethanol.

5. Thanh lọc và bảo quản kháng huyết thanh

5.1 Kháng huyết thanh pha loãng với PBS và khối lượng khác, 5000-10000/phút ly tâm trong 15 phút, lấy sạch.

5.2 Rửa các cột ái lực kháng nguyên bằng PBS 10x khối lượng để cân bằng các cột.

5.3 Pha loãng kháng huyết thanh 10m vào cột cân bằng tốt.

5.4 Nhẹ nhàng trộn và lắc trong 2-4 giờ ở nhiệt độ phòng, hoặc 4'C qua đêm

5.5 Rửa các cột kháng nguyên bằng PBS 10x khối lượng để rửa các heteroprotein gắn vào cột

5.6 Rửa các cột bằng dung dịch tẩy kháng thể 2x để có được kháng thể đặc hiệu

5.7 Cân bằng cột với PBS 10x khối lượng

5.8 Cô lập các cột với 20% rượu, 4'C để bảo quản.

Sau khi thu được kháng thể tẩy rửa, lọc máu khử muối trong PBS sau khi được cô đặc bằng sucrose hoặc polyglycol, giá trị ODD kháng thể được xác định ở bước sóng 280nm bằng máy quang phổ UV-Visible, giá trị ODD thu được chia cho 1,35 là nồng độ kháng thể được đo và thêm 40-50% glycerin ở 20 ^ C để bảo quản lâu dài.

Một số dịch vụ thử nghiệm