Cấu trúc mô cục bộ Thuốc nhuộm huỳnh quang HistoBright

Thuốc nhuộm huỳnh quang cho phép hình dung cấu trúc mô cục bộ

HistoBright

HistoBright là một loại sắc tố huỳnh quang phản ứng môi trường được kích thích bởi các photon kép, với độ thấm mô tuyệt vời để thay đổi các đặc tính huỳnh quang theo cấu trúc cục bộ của mô, do đó cho phép hình dung mô có độ tương phản cao. Kết hợp với xử lý mô minh bạch và sử dụng kính hiển vi laser photon kép, các khối mô có thể được quan sát sâu và phân tích cấu trúc không gian.

※Sản phẩm này dựa trên kết quả nghiên cứu của Đại học Kochi và Đại học Ehime, được sản xuất và tiếp thị bởi funakoshi (chủng).

※Sản phẩm này chỉ dành cho mục đích nghiên cứu và không có sẵn cho các mục đích khác ngoài nghiên cứu.

HistoBright là một loại thuốc nhuộm huỳnh quang đáp ứng môi trường có thể hiển thị một loạt các bước sóng dựa trên độ phân cực của dung môi. Khi áp dụng cho các mô sau khi xử lý minh bạch, huỳnh quang thay đổi để đáp ứng với môi trường vi mô trong mô, sau đó hợp tác với ánh sáng képKính hiển vi laser con có thể quan sát rõ ràng cấu trúc tổ chức.

◆ Phương pháp phân tích cấu trúc tổ chức truyền thống và phân tích cấu trúc tổ chức ba chiều mới

Phân tích cấu trúc mô truyền thống được thực hiện bằng cách nhuộm các mô bằng thuốc nhuộm màu, chẳng hạn như phương pháp nhuộm sumogen-ihon (HE). Mà sử dụng những chất nhuộm màu này rất khó nhuộm màu nguyên khối tổ chức, thông thường cần làm thành lát mỏng rồi mới tiến hành quan sát. Nhưng các lát mỏng có thể dễ dàng mất thông tin ba chiều của cấu trúc mô, vì vậy cần phải chuẩn bị rất nhiều lát để tái tạo cấu trúc ba chiều.

HistoBright, một loại thuốc nhuộm huỳnh quang đáp ứng môi trường mới (hợp chất trong luận án gốc có tên PC) được tổng hợp bởi Tiến sĩ Yangsuke Renko thuộc Khoa Nghiên cứu Giáo dục của Đại học Kochi, hiện đang được tiến hành phát triển thuốc nhuộm hình ảnh huỳnh quang được áp dụng cho cấu trúc mô ba chiều bởi Tiến sĩ Kenshige Imamura, Masaki Murakami, Tiến sĩ Ryosuke Kawakami từ Khoa Y của Đại học Ehime. HistoBright thu thập trên màng sinh học và tùy thuộc vào môi trường địa phương, huỳnh quang ởĐèn xanh~Gần ánh sáng hồng ngoạiBiến hóa trong phạm vi lớn. Do đó, khi HistoBright được áp dụng cho các mô sinh học, nó có thể gây ra những thay đổi trong màu huỳnh quang dựa trên cấu trúc mô, cho phép quan sát cấu trúc mô có độ tương phản cao. Vì HistoBright có khả năng kích thích hai photon, nên có thể quan sát bằng cách sử dụng kính hiển vi laser hai photon ngoài kính hiển vi đồng tập trung laser. Ngoài ra, phối hợp với quá trình minh bạch mô (ngoài các phương pháp duy trì cấu trúc màng cho các hoạt động tẩy nhờn), việc sử dụng HistoBright cho phép quan sát các mẫu mô dày mà không phá hủy cấu trúc mô (không chuẩn bị các lát mỏng) và hình ảnh sâu thông qua kính hiển vi laser photon kép để thực hiện phân tích cấu trúc ba chiều của mô.

◆ Tính năng

● Thuốc thử nhuộm màng đáp ứng môi trường, có thể hiển thị theo môi trường xung quanhĐèn xanh~Gần ánh sáng hồng ngoạiĐặc tính huỳnh quang. Các nút mô cục bộ có độ tương phản cao có thể đạt được bằng cách phân biệt các dải bước sóng huỳnh quang cần được phát hiện

Cấu trúc hình ảnh.

●Các phương pháp điều trị minh bạch mô kết hợp với các phương pháp điều trị không tẩy nhờn (như RapiClear (SunJin Lab), LUCID, v.v.) cho phép phân tích 3D sâu về cấu trúc tổ chức.

●※ Việc sử dụng chất hoạt động bề mặt (Triton X-100, Tween 20, v.v.) sẽ hòa tan màng lipid trong mô và có thể ảnh hưởng đến việc nhuộm HistoBright, vì vậy không nên sử dụng. Để sử dụng, vui lòng thảo luận về các điều kiện áp dụng.

●Có thể quan sát bằng cách sử dụng kính hiển vi laser co-focus (laser 488 nm được khuyến nghị) hoặc kính hiển vi laser photon kép (laser 960 nm được khuyến nghị).

●Khi quan sát bằng kính hiển vi laser hai photon, hình ảnh phát sinh hài hòa thứ cấp (SHG) có thể được phối hợp để quan sát các sợi collagen trong mô không nhuộm trong khi sử dụng thuốc thử này.

●Sau khi nhuộm và quan sát bằng HistoBright, có thể thực hiện nhuộm HE.

◆ Nguyên bản gốc

Inoue, K.,et al., J. Mater. Hóa học.B.,10(10), 1641～1649 (2022). Tính chất tổng hợp và quang vật lý của một thuốc nhuộm pyrene đẩy kéo mới với phát xạ màu xanh lá cây đến màu đỏ xa và ứng dụng của nó cho hình ảnh tế bào và mô da của con người. [PMID:35194628]

◆ Nguyên tắc

Phổ kích thích/phát xạ

HistoBright là thuốc nhuộm huỳnh quang phản ứng phân cực dung môi (Solvatochromic fluorescent dye) làm thay đổi tính chất huỳnh quang dựa trên phân cực phân tử của dung môi. Tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi, huỳnh quang sẽ phát ra từxanh lá cây(cực thấp) hướngGần ánh sáng hồng ngoạiThay đổi lớn trong phạm vi (tính cực cao).

Thay đổi quang phổ huỳnh quang trong mô hình màng liposome

HistoBright cho thấy ái lực cao đối với màng lipid và thể hiện các đặc tính huỳnh quang khác nhau tùy thuộc vào trạng thái pha của màng lipid. Không giống như tối đa huỳnh quang trong liposome của mô hình pha Lo có trật tự (sphinphospholipid (SM)/chole-solid-alcohol (Chol)), bước sóng tối đa trong liposome của mô hình pha LD mất trật tự (DOPC) cũng được chuyển sang phạm vi bước sóng dài khoảng 30 nm và năng suất lượng tử huỳnh quang cũng giảm từ 0,72 (SM/Chol) xuống 0,37 (DOPC).

※ Dữ liệu quang phổ huỳnh quang trên được cung cấp bởi Tiến sĩ Renzi Yangsuke, Đại học Kochi.

◆ Dữ liệu ứng dụng

Hình ảnh mô da bình thường của người trong suốt bằng cách sử dụng kính hiển vi laser photon kép

Sau khi một khối mô da bình thường của một người được cố định bằng paraformaldehyde/PBS 4%, nó được chuẩn bị thành một lát 500μm với 76 giờ điều trị minh bạch mô (LUCID) và nhuộm HistoBright (10μM). Thông qua kính hiển vi laser photon kép, các khối mô được kích thích bằng laser ở 960 nm, tương ứng ở 492 nm (SHG:xanh lam）、500-550 nm（xanh lá cây）、560~593nm（màu camChương 593 - 690nm (màu đỏ) Lấy hình ảnh huỳnh quang lần lượt, làm ra 4 hình ảnh tổng hợp sau đây.

※ 492 nm（xanh lamTín hiệu SHG có nguồn gốc từ sợi collagen trong mô, không phải từ tín hiệu huỳnh quang có nguồn gốc HistoBright.

Tiếp theo, hình ảnh 500 μm được chụp liên tục theo khoảng cách 5 μm theo hướng trục Z bằng kính hiển vi laser photon kép và được xây dựng ba chiều bằng phần mềm phân tích hình ảnh để hình dung cấu trúc tinh tế của mô da người theo cách ba chiều.

Hình ảnh 3D mô da bình thường của một người trong suốt bằng kính hiển vi laser photon kép

Sau khi sử dụng paraformaldehyde/PBS 4% để cố định các khối mô da bình thường của con người, một lát cắt 1 mm được chuẩn bị đồng thời với 72 giờ điều trị minh bạch mô (RapiClear, SunJin Lab Inc.), HistoBright (10 μM) nhuộm và nhuộm hạt nhân (Hoechst33342). Thông qua kính hiển vi laser photon kép, các khối mô được kích thích bằng laser ở 1100 nm, tương ứng ở<492 nm (SHG:xanh lam）、500~550 nm（xanh lá cây）、560~593 nm（màu camChương 593 - 690nm (màu đỏ) Lấy hình ảnh huỳnh quang lần lượt, làm ra 4 hình ảnh tổng hợp sau đây. Dựa trên các điều kiện trên, chụp liên tục trong khoảng thời gian 5 μm theo hướng trục Z, xây dựng ba chiều bằng phần mềm phân tích hình ảnh, làm cho dữ liệu liên tục hoạt hình.

＊ Khối mô trong thí nghiệm này không được xử lý xuyên qua màng sau khi cố định, xử lý và nhuộm trực tiếp.

Xem video đầy đủ: labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1646.html

Lặp lại cho HE nhuộm

Sử dụng HistoBright để nhuộm và quan sát các khối mô tế bào da bình thường của một người, để yên trong PBS, loại bỏ các tác nhân rõ ràng. Sau đó chuẩn bị thành lát mỏng, tiến hành nhuộm HE. Sau khi nhuộm HistoBright đã được xác nhận, việc nhuộm HE rõ ràng vẫn có thể được thực hiện.

Xem nhuộm dưới kính hiển vi laser co-focus và kính hiển vi laser kép photon

Sau khi sử dụng paraformaldehyde/PBS 4% để cố định khối mô da bình thường của một người, nó được chuẩn bị thành một lát 0,5 mm, đồng thời với 72 giờ điều trị minh bạch mô (RapiClear, SunJin Lab Company) * và nhuộm HistoBright (10 μM). Sau đó, các quan sát được thực hiện bằng cách sử dụng kính hiển vi laser co-focus (bên trái: laser 488 nm kích thích ánh sáng) và kính hiển vi laser photon kép (bên phải: laser 960 nm kích thích ánh sáng). Mặc dù không có sự khác biệt rõ ràng giữa hai hình ảnh, tín hiệu SHG kích thích bởi các photon kép (sợi collagen) có thể được quan sát dưới kính hiển vi laser photon kép.

＊ Khối mô trong thí nghiệm này không được xử lý xuyên qua màng sau khi cố định, xử lý và nhuộm trực tiếp.

※ Tất cả các dữ liệu hình ảnh trên được cung cấp bởi Tiến sĩ Ryosuke Kawakami, Đại học Ehime.

◆ Danh sách sản phẩm