Máy huỳnh quang quét vi sai cao SUPR-DSF

Protein ổn định

Tính ổn định protein là một trong những thuộc tính chất lượng quan trọng của thuốc công nghệ sinh học, nó xác định hiệu quả, tính khả thi sản xuất, tính an toàn và thời hạn sử dụng của thuốc sinh học. Protein ổn định cấu trúc tiên tiến đảm bảo rằng protein vẫn hoạt động và an toàn trong suốt cuộc đời của nó.

Nghiên cứu ổn định được sử dụng để xác nhận sự ổn định của cấu trúc HOS cao cấp của protein trong các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như nhiệt độ, độ pH, thành phần phụ liệu và thời gian lưu trữ, để xác định các điều kiện lưu trữ và vận chuyển thích hợp. Đồng thời, các cơ quan quản lý như FDA, EMA và các cơ quan khác cũng yêu cầu dữ liệu ổn định rộng rãi trước khi phê duyệt việc sử dụng thuốc sinh học được phép. Do đó, sự hiểu biết và đảm bảo sự ổn định cấu trúc tiên tiến của thuốc protein điều trị là cần thiết cho các doanh nghiệp dược phẩm sinh học để phát triển các loại thuốc an toàn và hiệu quả, và các nhà nghiên cứu cần phân tích và đánh giá sự ổn định cấu trúc tiên tiến của protein ở nhiều giai đoạn R&D và sản xuất.

Phương pháp phân tích sự ổn định của protein

Phân tích sự ổn định của protein thường được nghiên cứu bằng cách sử dụng các phương pháp sau:

Phương pháp sinh hóa

2 sắc ký tròn (Circular Dichroism Spectroscopy)

Phương pháp nhiệt lượng quét khác biệt (DSC)

Công nghệ PCR định lượng (qPCR) (DSF huỳnh quang bên ngoài)

Phân tán ánh sáng động (DLS) so với phương pháp phân tán ánh sáng tĩnh (SLS)

Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai (DSC) thường được coi là giải pháp quan trọng nhất để phân tích sự ổn định protein, tuy nhiên, do nhu cầu phân tích nhanh chóng đối với số lượng lớn các mẫu được lưu trữ trên các tấm micropore, chẳng hạn như 96 hoặc 384 lỗ, DSC có một số hạn chế đối với việc sử dụng trong sàng lọc thuốc và phát triển sớm. Do đó, DSF (Phương pháp huỳnh quang nội nguồn) đã trở thành một giải pháp phổ biến và hiệu quả về chi phí.

DSF (Phương pháp huỳnh quang nội sinh) cho phép đo nhanh toàn bộ tấm micropore của mẫu mà không cần đánh dấu mẫu hoặc sử dụng bất kỳ đầu dò huỳnh quang nào và cung cấp dữ liệu thông lượng cao để hỗ trợ sàng lọc các ứng cử viên mẫu và các thành phần công thức.

Phương pháp DSF nhanh chóng sàng lọc một số lượng lớn các mẫu, cải thiện đáng kể hiệu quả sàng lọc thuốc, phân tích dược phẩm, kết quả phân tích và công nghệ DSC xác minh trực giao với nhau. Đối với nhiều loại thuốc công nghệ sinh học, việc sử dụng phương pháp DSF để sàng lọc nhanh và số lượng lớn, sử dụng công nghệ DSC để xác minh trực tiếp kết quả sàng lọc sớm của DSF, là một chương trình hiệu quả để sàng lọc thuốc và phát triển thuốc.

Nguyên tắc kỹ thuật DSF:

Phương pháp huỳnh quang quét vi sai (DSF) là một kỹ thuật vật lý sinh học hiệu quả và dễ sử dụng để xác định nhiệt độ biến tính của protein (giá trị Tm hoặc giá trị Cm biến tính hóa học) bằng cách phát hiện những thay đổi tương ứng trong phổ phát xạ huỳnh quang khi nhiệt độ tăng hoặc khi có tác nhân biến tính.

Nghiên cứu đã phát hiện ra rằng các axit amin vòng thơm trong các phân tử protein trải qua sự dịch chuyển trong quang phổ phát xạ tối đa của huỳnh quang nội nguồn mà chúng bị kích thích khi chúng ở trong môi trường vi mô với các cực khác nhau, chẳng hạn như kỵ nước hoặc ưa nước. huỳnh quang nội sinh trong protein chủ yếu đến từ các axit amin vòng thơm như tryptophan (Trp), phenylalanine (Phe) và tyrosine (Tyr), trong đó nội sinh tryptophan có huỳnh quang mạnh.

Lấy tryptophan làm ví dụ, trong môi trường vi hạt nhân kỵ nước của protein, bước sóng phát xạ tối đa huỳnh quang nội sinh của nó là khoảng 330nm, trong khi trong môi trường vi phân cực ưa nước, bước sóng phát xạ tối đa huỳnh quang nội sinh của tryptophan xuất hiện khoảng 350nm. Sự thoái hóa nhiệt hoặc hóa học của protein thường gây ra sự thay đổi phân cực trong môi trường vi mô xung quanh dư lượng tryptophan, khiến tryptophan, thường được bao bọc trong lõi kỵ nước của protein, dần dần tiếp xúc với môi trường ưa nước, dẫn đến dịch chuyển đỏ (Red Shift) trong bước sóng phát xạ tối đa của huỳnh quang bên trong, di chuyển đến vùng bước sóng lớn hơn.

Phương pháp này để theo dõi sự thay đổi huỳnh quang nội nguồn tryptophan mà không cần đầu dò huỳnh quang hoặc nhãn, tránh kết quả dương tính giả như huỳnh quang nền và hấp phụ không đặc hiệu trong DSF huỳnh quang ngoại lai truyền thống.

Khi protein bị khử nếp do thoái hóa nhiệt hoặc các tác nhân thoái hóa hóa học (như guanidine hydrochloride, urê, v.v.), quá trình phát triển protein có thể được nghiên cứu bằng cách đo huỳnh quang nội sinh với sự thay đổi nhiệt độ hoặc chất thoái hóa. Dữ liệu từ những thay đổi này có thể được sử dụng để tạo ra các đường cong nóng chảy và lấy giá trị Tm của nhiệt độ chuyển đổi nhiệt rõ ràng. Tonset、 Biến van der Waentanpi (ΔH), năng lượng tự do Gibbs (ΔG), giá trị Cm biến tính hóa học, vv được sử dụng để đánh giá và dự đoán sự ổn định của protein.

DSF truyền thống thường sử dụng tỷ lệ 350/330 để phân tích dữ liệu, trong khi SUPR-DSF cung cấp một số phương pháp phân tích, ngoài tỷ lệ, SUPR-DSF cung cấp BCM (Barycentric Mean), cho phép tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn tốt hơn so với tỷ lệ 350/330 trong khi thuận lợi hơn cho việc phân tích các mẫu protein nồng độ thấp.

Máy huỳnh quang quét vi sai cao SUPR-DSFCác tính năng chính của hệ thống:

Với tấm micropore 384 tiêu chuẩn, không cần vật tư tiêu hao và mao dẫn đặc biệt

Sàng lọc thông lượng cao, có thể được hoàn thành trong một quá trình làm nóng (60-80 phút)

Thử nghiệm tấm micropore 384 khối duy nhất sử dụng huỳnh quang bên trong, không cần thuốc nhuộm hoặc nhãn, tương thích với hệ thống sinh học phổ biến UV LED kích thích phù hợp với phát hiện phổ đầy đủ

Chỉ cần 10-30μl mẫu, nồng độ mẫu 0,05~250mg/mL

Thu được các thông số chính: Tonset, Tm, ΔHe, ΔG, Cm và Affinity, v.v.

Cung cấp chất lượng dữ liệu nghiêm ngặt và khả năng lặp lại

Máy huỳnh quang quét vi sai cao SUPR-DSFỨng dụng của hệ thống:

Hệ thống SUPR-DSF được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nghiên cứu cơ bản về khoa học đời sống và nghiên cứu và phát triển dược phẩm:

Tải Accelerated Mutants

Sàng lọc và tối ưu hóa công thức và tiền công thức

sàng lọc điều kiện tinh thể protein

Đánh giá Interbatch Consistency

Đánh giá Biosimilar

Nghiên cứu ứng suất tăng tốc và suy thoái cưỡng bức

Kết hợp với phân tích thay đổi cấu hình gây ra

Đánh giá Post-Translation

Nhiệt độ không đổi và phân tích ổn định hóa học

Thông số kỹ thuật của hệ thống SUPR-DSF:

Trường hợp ứng dụng điển hình -Tải Accelerated Mutants

16 mẫu được so sánh và sàng lọc bằng SUPR-DSF, bao gồm 1 protein dạng hoang dã (WT) và 15 đột biến một điểm. Trong vòng 1,5 giờ, thiết bị DSF đã tạo ra một đường cong nóng chảy chất lượng cao gồm 48 mẫu (3 lần lặp lại cho mỗi bộ) (dữ liệu có thể tạo ra tới 384 lỗ trong cùng một khoảng thời gian). Phù hợp với dữ liệu với mô hình, giá trị Tm nhiệt độ nóng chảy thu được và sắp xếp và sàng lọc độ ổn định.

Như thể hiện trong Hình 1, đường cong nóng chảy của 3 trong số các đột biến (9, 13 và 14) được dịch sang trái so với WT (màu xanh), cho thấy sự giảm ổn định protein của chúng; Sự ổn định của 12 người đột biến còn lại đều được cải thiện. Trong số này, đột biến 1, 8 và 12 có sự gia tăng ổn định lớn nhất.

Hình 2 cho thấy đường cong nóng chảy của một số mẫu đại diện cho thấy một số protein trải qua một quá trình chuyển đổi nhiệt duy nhất (protein WT so với đột biến 7 và 8), trong khi những protein khác (đột biến 1 và 14) cho thấy rõ ràng hai quá trình chuyển đổi nhiệt, đó là hai điểm uốn trên đường cong nóng chảy. Dữ liệu được cung cấp thông qua SUPR-DSF có thể giúp các nhà nghiên cứu sàng lọc các ứng cử viên đầy hứa hẹn để nghiên cứu sâu hơn.

Phân tích chính xác vùng Fab của mumab

Sử dụng SUPR-DSF để thu được dữ liệu huỳnh quang quét vi sai cho NISTmAb (tiêu chuẩn NIST mumab) và so sánh kết quả với dữ liệu thu được bằng phương pháp nhiệt lượng quét vi sai (DSC). SUPR-DSF có thể phân tích tất cả ba miền của NISTmAb: CH2 (69 ° C), CH3 (83 ° C) và vùng Fab (94 ° C). Với nhiệt độ quét tối đa 105 ° C, SUPR-DSF có thể đo chính xác nhiệt độ nóng chảy của vùng Fab ổn định bất thường, trong khi các nền tảng DSF khác có nhiệt độ quét tối đa 95 ° C, dễ dàng mất thông tin quan trọng về sự thoái hóa của vùng Fab đơn kháng (Hình 5 (a)).

So sánh dữ liệu sau khi chuẩn hóa SUPR-DSF với kết quả DSC. Như thể hiện trong Hình 5 (b), ba đỉnh khớp với nhau, chứng minh tính nhất quán tốt của hai kỹ thuật và thông tin ổn định protein chất lượng cao có thể dễ dàng thu được bằng cách sử dụng SUPR-DSF.

Trường hợp ứng dụng điển hình - sàng lọc phụ liệu và công thức để tăng tốc trastuzumab

Công thức của các loại thuốc trị liệu sinh học như kháng thể là cơ sở để đảm bảo hiệu quả, khả năng sản xuất và an toàn, đồng thời xác định các điều kiện lưu trữ và vận chuyển. Các công ty dược phẩm đang rất cần các phương pháp thông lượng cao để sàng lọc nhanh chóng và đáng tin cậy một số lượng lớn các kết hợp điều kiện để xác định công thức tốt nhất.

Sử dụng SUPR-DSF, các nhà nghiên cứu đã sàng lọc và phân tích sự ổn định của kháng thể điều trị trastuzumab trong 96 điều kiện khác nhau và hoàn thành thử nghiệm trong vòng 1,5 giờ. Kết quả kiểm tra rất phù hợp với kết quả của phương pháp nhiệt lượng quét khác biệt (DSC). Việc sàng lọc hàng ngàn mẫu có thể được thực hiện mỗi ngày nếu thiết bị tự động hóa phòng thí nghiệm được tích hợp.

Đường cong nóng chảy DSF cho thấy hai khu vực chuyển đổi riêng biệt, phù hợp với dữ liệu bằng phương pháp bình phương tối thiểu, có thể xác định giá trị Tonset, giá trị Tm và biến van der Waals entanpy (△ H). Hình 3 (a, b) cho thấy đường cong nóng chảy và biểu đồ phù hợp của các phụ kiện phá hủy/tăng cường sự ổn định tương ứng. Hình 4 (a) liệt kê tất cả các phụ liệu (so với mẫu kiểm soát) có thể cải thiện sự ổn định của kháng thể.

SUPR-DSF xác định chính xác tác dụng ổn định của histidine và trehalose, các phụ liệu được sử dụng trong trastuzumab đã được bán trên thị trường, như thể hiện trong Hình 4 (b), với dữ liệu SUPRDSF có độ tin cậy và tính nhất quán tuyệt vời trong khi cung cấp thông lượng cao đáng kinh ngạc.

Sử dụng phương pháp huỳnh quang quét vi sai thông lượng cao để có được các thông số liên kết

Nghiên cứu phân tích kết hợp là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu và phát triển thuốc, đặc điểm tương tác và giá trị KD (phân tách hằng số cân bằng, đặc trưng cho ái lực liên kết giữa các phân tử) là rất quan trọng để lựa chọn các ứng cử viên, và các nhà nghiên cứu cần sử dụng nhiều phương pháp bổ sung nguyên tắc để sàng lọc và xác định hàng ngàn đến hàng chục nghìn hợp chất phân tử nhỏ trong thư viện.

Phân tích tương tác phân tử được thực hiện thông qua SUPR-DSF, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như hiệu ứng bề mặt, sự di chuyển của vật chất hoặc các vấn đề về độ gấp của bộ đệm, cung cấp các phép đo thông lượng cao, không cần đánh dấu trong phạm vi nồng độ liên kết phân tích.

Nó có thể được sử dụng để xác nhận tính đặc hiệu của liên kết bằng cách phát hiện những thay đổi ổn định trong phức hợp phối tử protein; Giá trị KD có thể được tính toán bằng cách thay đổi phổ phát xạ huỳnh quang tại thời điểm thoái hóa nhiệt và mối quan hệ hàm của nồng độ phối tử. Ngay cả đối với các phân tử liên kết rất yếu, sự thay đổi ổn định do liên kết gây ra có thể được phát hiện bởi SUPR-DSF.

Với tấm micropore 384 tiêu chuẩn, nó có thể sàng lọc sự ổn định của hàng ngàn mẫu trong một ngày để xác nhận trạng thái liên kết.

Sử dụng SUPR-DSF để nghiên cứu hoạt động liên kết của phối tử (TFMSA) với anhydrase cacbonat I của con người, đường cong nóng chảy của anhydrase cacbonat thay đổi theo nồng độ TFMSA được thể hiện trong Hình 6.

Hình 7 cho thấy mối quan hệ giữa giá trị Tm của anhydrase cacbonat I của con người và nồng độ TFMSA, với hai giá trị KD thu được khi phù hợp là 2,1 μM và 174,2 μM, với

Các giá trị số trong tài liệu phù hợp chứng minh rằng SUPR-DSF có thể được sử dụng như một công cụ sàng lọc hoặc xác nhận trước cho các nghiên cứu liên kết phối tử và có độ nhạy.

Phần mềm trực quan và đơn giản

Phần mềm SUPR-DSF cung cấp thiết kế thử nghiệm và phân tích dữ liệu trực quan, đơn giản, thông minh và hiệu quả, cho phép người mới bắt đầu nhanh chóng và nhiều tùy chọn nâng cao cho người dùng dày dạn kinh nghiệm.

Về ProteinStable

Một công ty con của Applied Photophysics, nhằm mục đích giới thiệu các công nghệ lấy khách hàng làm trung tâm vào thị trường sàng lọc và mô tả protein, tập trung vào các phương pháp đặc tính protein thông lượng cao, kích thước mẫu thấp để tăng năng suất mà không ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu.

Giới thiệu về AppliedPhotophysics

Applied Photophysics, một công ty vật lý quang học ứng dụng của Anh, đã cung cấp các chương trình chuyên nghiệp trong nhiều thập kỷ cho nghiên cứu cấu trúc và chức năng của thuốc sinh học, bao gồm máy quang phổ CD hai màu tròn, máy phân tích động lực phản ứng dòng chảy dừng, máy phân tích ổn định protein SUPR DSF

Đợi đã. Người dùng trải rộng khắp các trường đại học và viện nghiên cứu khoa học và các công ty dược phẩm trên toàn thế giới.

Chirascan Series Circular Dichromatic CD Spectroscope, được sử dụng rộng rãi trong các đặc tính cấu trúc tiên tiến của thuốc sinh học như protein, bao gồm cấu trúc bậc hai của protein, phân tích cấu trúc bậc ba, và ổn định nhiệt của cấu trúc bậc hai, nghiên cứu ổn định nhiệt của cấu trúc bậc ba.