1. Thử nghiệm này đề cập đến GB 5009.299-2024, NY/T 4439-2023 và các tiêu chuẩn nhóm và tiêu chuẩn doanh nghiệp liên quan để xác định hàm lượng lactoferrin trong sữa tiệt trùng, sữa tiệt trùng siêu nhiệt và sữa công thức cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.

2. Để có được hình dạng và độ tách tốt, thử nghiệm được tối ưu hóa thích hợp cho việc xử lý mẫu trước và điều kiện sắc ký lỏng, ở nhiệt độ cột 30 ℃, tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút, để0,1% nước axit trifloacetic - 0,1% axit trifloacetic acetonilKhi rửa gradient như một pha dòng chảy, giá trị áp suất tối đa của hệ thống không vượt quá 106 bar.

3. Kết quả thử nghiệm cho thấy: dung dịch tiêu chuẩn lactoferrin (50,0 μg/mL) hệ số bất đối xứng đỉnh sắc ký 1,00, hình dạng đỉnh tốt, số lượng tấm tháp lý thuyết 30549, hiệu quả cột tuyệt vời; Ba lần lấy mẫu liên tiếp, thời gian giữ lại và RSD của khu vực đỉnh đều nhỏ hơn 1%, khả năng tái tạo phương pháp tốt; Điểm thấp tuyến tính (1,00 μg/mL) tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn là 8,2, độ nhạy phương pháp cao hơn; Phạm vi tuyến tính 1,00-200 μg/mL, hệ số tương quan tuyến tính r²≥ 0,9998, tuyến tính tốt.

4. Trong các thử nghiệm để xác định hàm lượng lactoferrin trong các sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng nghịch pha, cột sắc ký BioBasic 4 (khẩu độ 300 Å) kết hợp với hệ thống sắc ký lỏng hiệu quả cao Vanquish Core, cho thấy khả năng tái tạo tốt và ổn định tuyệt vời. Giới hạn phát hiện phương pháp và giới hạn định lượng đều đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn và có sẵn cho các doanh nghiệp sữa và phòng thí nghiệm kiểm tra thực phẩm để tham khảo.

1.1 Khai thác mẫu

1.1.1Mẫu chất lỏng: sữa nhiệt độ thấp (sữa tươi, sữa tiệt trùng)/sữa nhiệt độ bình thường (sữa tiệt trùng nhiệt độ cực cao (UHT)

Lấy mẫu thử 5 g (chính xác đến 0,1 mg) trong ống ly tâm 50 mL có nắp xoay, dung tích ổn định đến 25,0 mL bằng dung dịch đệm phosphate, chiết xuất dao động xoáy 3 phút, 12.000 vòng/phút 4 ℃ ly tâm 15 phút. Nhiệt độ trong phòng được đặt yên tĩnh, loại bỏ mỡ nổi trên tầng, lấy dịch thanh lọc.

1.1.2Mẫu rắn: Sữa bột (sữa công thức cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ)

Lấy mẫu thử 2 g (chính xác đến 0,1 mg) trong ống ly tâm 50 mL với nắp xoay quy mô, thêm một lượng vừa phải dung dịch đệm phosphate II rung nhiệt hòa tan, dung tích ổn định với dung dịch đệm phosphate Ⅱ đến 50,0 mL, chiết xuất sốc xoáy 3 phút, để yên trên 30 phút, 12.000 vòng/phút 4 ℃ ly tâm 15 phút. Nhiệt độ trong phòng được đặt yên tĩnh, loại bỏ mỡ nổi trên tầng, lấy dịch thanh lọc.

1.2 Làm sạch mẫu

1.2.1Kích hoạt: HyperSep Heparin Affinity Cột (P/N: 60105-110-B) Đầu nối Luer thấp hơn được kết nối với thiết bị chiết pha rắn, đầu trên thông qua bộ chuyển đổi (P/N: 60105-110-B) ống tiêm 10 mL trong loạt, thêm 2 × 5 mL đệm phosphate II Kích hoạt Heparin Affinity, kiểm soát tốc độ nhỏ giọt 2d/3s;

1.2.2Mẫu trên: Để kích hoạt bề mặt chất lỏng tiếp cận tấm màn hình cột nhỏ, chính xác di chuyển 10,0 mL chất lỏng mẫu trên vào ống tiêm trống xi lanh (P/N: S7510-10), kiểm soát tốc độ nhỏ giọt 2d/3s, loại bỏ chất lỏng chảy ra;

1.2.3Rửa: để lấy mẫu bề mặt chất lỏng khi tiếp cận tấm màn hình cột nhỏ, thêm 2 × 5 mL dung dịch đệm phosphate Ⅱ để rửa cột nhỏ, loại bỏ chất lỏng chảy ra, loại bỏ bộ điều hợp và ống tiêm trống xi lanh, áp suất âm rút khô cột nhỏ 2 phút;

1.2.4Tẩy rửa: Thêm 2 × 2,5 mL Phosphate Buffer Ⅰ Tẩy rửa, thu thập tất cả các chất tẩy rửa và ổn định dung lượng lên đến 5,00 mL với Phosphate Buffer Ⅰ, trên 0,2 μm Bộ lọc kim PTFE ưa nước (P/N: 42213-NPL), bộ lọc được kiểm tra trên máy bay.

Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu suất cao, cấu hình: Bơm Quaternary Pump C (VC-P20-A), Bộ lấy mẫu tự động Split Sampler CT (VC-A12-A), Hộp nhiệt độ cột Column Compartment C (VC-C10-A), Máy dò Diode Array Detector CG (VC-D11-A), Xử lý dữ liệu Chromeleon ™ 7.3

Cột sắc ký: BioBasic 4, 5μm, 4,6 × 250 mm (P/N: 72305-254630)

Pha chảy: A: 0,1% nước axit trifluoroacetic B: 0,1% axit trifluoroacetic acetonil

Tốc độ dòng chảy: 1,0 mL/phút

Thủ tục rửa gradient:

Khối lượng mẫu: 50 µL

Nhiệt độ cột: 30 ℃

Máy dò: DAD, Bước sóng thu thập: 280 nm; Tần số thu thập: 5 Hz; Thu thập phổ: 190-400 nm