Lời nói đầu

Các chất kết hợp thuốc kháng thể-phân tử nhỏ (ADC), là một loại sản phẩm sinh học trị liệu, có thể xác định chính xác các tế bào đích bằng kháng thể, giải phóng các thuốc phân tử nhỏ kết hợp sau khi xâm nhập vào tế bào đích thông qua endocytosis, do đó đạt được mục đích tiêu diệt chính xác tế bào đích và ở mức độ tối đa giảm tiêu diệt tế bào bình thường. Do nguyên tắc thiết kế của ADC, nó được so sánh với hình ảnh "tên lửa sinh học", kể từ khi thuốc ADC Mylotarg đầu tiên vào năm 2000. ® Sau khi được FDA chấp thuận, tính đến tháng 6 năm 2025, đã có 19 ADC được chấp thuận trên toàn thế giới. Kể từ khi tổng doanh số ADC toàn cầu lần đầu tiên vượt 10 tỷ USD vào năm 2023, tổng doanh số ADC toàn cầu tiếp tục vượt 10 tỷ USD vào năm 2024, tiếp tục đà tăng trưởng mạnh mẽ.

Đứng thứ hai trong số 10 ADC hàng đầu thế giới về doanh số ADC năm 2024 là KADCYLA (Emetritub, Hercelet) do Roche sản xuất. Thuốc đã được FDA chấp thuận để đưa ra thị trường vào năm 2013 để điều trị ung thư vú dương tính với HER2 và đạt doanh thu toàn cầu khoảng 2,3 tỷ USD vào năm 2024. Emetrituzumab là một ADC nhắm mục tiêu HER2, chứa kháng thể kháng nhân hóa -HER2 IgG1 trastuzumab, liên kết cộng hóa trị với thuốc ức chế vi ống DM1 (dẫn xuất metansin) bằng cách kết nối thioether ổn định MCC (4-[N-maleylamide methyl] cyclohexane-1-carboxylate) với phân phối trọng lượng phân tử từ 147~158 kDa, tỷ lệ khớp nối thuốc/muab (drug to antibody ratio, DAR) là 0~8, phân phối trung bình khoảng 3,5 [3]. Do sự phức tạp của cấu trúc, việc biểu thị nó có vẻ rất thách thức. Trong nghiên cứu của bài viết này, chúng tôi sử dụng những gì vừa được công bố tại Hội nghị thường niên về phổ khối Hoa Kỳ (ASMS) năm nay.Máy đo phổ khối độ phân giải cao 2 trong 1 Excedion Pro BiopharmaMột mô tả toàn diện về KADCYLA đã chứng minh khả năng phân tích tuyệt vời của nền tảng này trong lĩnh vực dược phẩm sinh học, đặc biệt là chức năng phân tách điện tử hỗ trợ va chạm năng lượng cao (EThcD), giúp xác định chính xác các vị trí ghép nối thuốc cũng như xác định các biến đổi sau dịch thuật (Post-translational modification - PTM).

Ứng dụng nổi bật

Như đã đề cập ở trên, Excedion Pro Biopharma, một thế hệ mới của quang phổ khối phân giải cực cao 2 trong 1, được phát hành trong năm nay, được sử dụng để mô tả chi tiết KADCYLA. Điểm nổi bật của thiết bị này bao gồm, nhưng không giới hạn, mở rộng phạm vi kiểm tra khối lượng m/z=12.000 Da (tùy chọn BioPharma cần được cấu hình), có thể đáp ứng các phép đo trọng lượng phân tử của monomer/dimer/trimer kháng thể đơn dòng trong điều kiện không biến tính, cũng như các phức hợp protein trọng lượng phân tử lớn khác; Chức năng ETD tùy chọn cho phép phân mảnh ETD/EThcD nhanh và nhạy, kết hợp với phân mảnh va chạm năng lượng cao (HCD), cho phép bảo hiểm chuỗi protein phong phú và thông tin xác định PTM. Cấu trúc của thiết bị Excedion Pro Biopharma được thể hiện trong Hình 1, cho thấy quy trình mô tả chuyên sâu KADCYLA trong thí nghiệm này.

Sơ đồ cấu trúc Excedion Pro BioPharma, được đánh dấu bằng màu xanh lam so với phần cập nhật phần cứng của thế hệ trước. Phiên bản BioPharma tùy chọn có thể mở rộng phạm vi kiểm tra chất lượng đến m/z=12.000 Da (phần hộp màu xanh lá cây) và ETD tùy chọn có thể cho phép phân mảnh ETD/EThcD (phần hộp màu đỏ). (Click để xem ảnh lớn)

Hình 2. KADCYLA mô tả sơ đồ dòng chảy.

(Click để xem ảnh lớn)

Trượt xuống để xem tất cả

Xác định trọng lượng phân tử hoàn chỉnh KADCYLA trong điều kiện không biến tính

Xác định trọng lượng phân tử đầy đủ là một trong những đặc tính không thể thiếu của các sản phẩm y sinh học, và đối với ADC, ngoài trọng lượng phân tử đầy đủ, giá trị DAR trung bình và phân phối tải thuốc (DLD) cũng là các thuộc tính quan trọng để đánh giá chất lượng thuốc. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã đo trọng lượng phân tử đầy đủ của KADCYLA trong điều kiện không biến tính. Các điều kiện không biến tính sử dụng một hệ thống muối đệm trung tính, trong đó các phân tử protein gần với trạng thái tự nhiên hơn so với các điều kiện biến tính, và trong điều kiện không biến tính, tích điện protein ít hơn và đỉnh khối phổ chồng chéo ít hơn giữa các trạng thái điện tích liền kề, cho phép giảm nhiễu lẫn nhau giữa các tín hiệu quang phổ khối, góp phần vào kết quả xác định trọng lượng phân tử hoàn chỉnh chính xác hơn. Hình 3 cho thấy kết quả của việc xác định trọng lượng phân tử hoàn chỉnh trong điều kiện không biến tính KADCYLA. Để đưa mẫu gần hơn với trạng thái tự nhiên, chúng tôi đã không khử đường. Như có thể thấy trong Hình 3A, ở cấp độ phổ ban đầu, đỉnh khối phổ của các số lượng thuốc khác nhau và các thành phần loại đường khác nhau về cơ bản đã đạt được sự phân tách cơ bản, sau khi giải tích tích chập có thể quan sát rõ ràng sự phân bố kết hợp thuốc 0~8 (Hình 3B), phần mềm BioPharma Finder có thể tự động tính toán giá trị DAR trung bình, giá trị DAR trung bình của ADC này là 3,47 (Hình 3C), phù hợp với 3,5 được báo cáo trong tài liệu.

(A)

(B)

(C)

Hình 3. Kết quả đo trọng lượng phân tử hoàn chỉnh KADCYLA trong điều kiện không biến tính. A, Các bản vẽ gốc và các bản vẽ lớn một phần. B, Sơ đồ phổ giải tích chập. Phần mềm BioPharma Finder có thể tự động chọn các thành phần liên quan và tính toán giá trị DAR trung bình. (Click để xem ảnh lớn)

Trượt xuống để xem tất cả

Phân mảnh phụ thuộc dữ liệu EThcD thứ cấp được sử dụng để phân tích biểu đồ peptide,

Đạt được vị trí vị trí ghép nối và nhận dạng PTM

Phân tích biểu đồ peptide dựa trên kết hợp chất lỏng là một trong những phương pháp phân tích thường được sử dụng trong đặc tính sản phẩm dựa trên liệu pháp sinh học, có thể đạt được độ bao phủ trình tự, định vị các vị trí sửa đổi hóa học khác nhau và phân tích định lượng định tính của các sửa đổi sau dịch thuật phổ biến, v.v. Trong các kỹ thuật phân mảnh phổ khối khác nhau, nó được sử dụng rộng rãi trong phân tích biểu đồ peptide do khả năng phân mảnh HCD để tạo ra các ion phân mảnh b/y phong phú sau khi phá vỡ liên kết peptide để xác định phân đoạn peptide. Tuy nhiên, đối với một số phân đoạn peptide biến đổi, chẳng hạn như glycopeptide, phân đoạn peptide khớp nối thuốc, v.v., vì HCD phá vỡ các liên kết đường/khớp nối thuốc, đối với phân đoạn peptide có nhiều vị trí biến đổi tiềm năng, việc sử dụng phân mảnh HCD không thể xác định chính xác vị trí biến đổi; Ngoài ra, đối với một số phân đoạn peptide có chứa các axit amin đồng phân, chẳng hạn như leucine/isoleucine, aspartate/aspartate đồng phân, v.v., không thể phân biệt được vì HCD tạo ra các ion b/y có cùng khối lượng. Và ETD, bởi vì cơ chế phản ứng khác nhau, có thể giữ lại hoàn toàn chuỗi đường, khớp nối thuốc và các sửa đổi chuỗi bên khác trong khi phân mảnh bộ xương peptide, đối với các axit amin đồng phân, cũng có thể tạo ra các ion chẩn đoán đặc trưng, do đó đạt được xác định và phân biệt các axit amin đồng phân. Việc bổ sung HCD-assisted fragmentation, EThcD, trên cơ sở phân mảnh ETD, có thể thu được cả hai ion b/y và c/z trong cùng một phổ thứ cấp để đạt được thông tin đầy đủ và phong phú hơn về phân đoạn peptide, đặc biệt là đặc tính của phân đoạn peptide biến đổi/đồng phân. Với tùy chọn ETD, Excedion Pro 2-in-1 mass spectrometer cho phép phân mảnh ETD/ETchD nhanh và nhạy, có thể thiết lập chế độ thu thập dữ liệu phụ thuộc dữ liệu EThcD MS2, dd EThcD MS2, bổ sung cho dữ liệu phụ thuộc HCD MS2 để có được thông tin phân tích biểu đồ peptide toàn diện.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân giải enzyme KADCYLA bằng cách sử dụng hai protease Trypsin và AspN tương ứng, tiếp theo là thu thập dữ liệu dd HCD MS2 và dd EThcD MS2 cho cả hai mẫu phân giải protease khác nhau để có được thông tin như độ bao phủ trình tự, phân chia vị trí khớp nối và sửa đổi sau dịch thuật. Sử dụng dd HCD MS2, Trypsin và AspN Enzyme Solution có thể đạt được độ bao phủ chuỗi 100% của một mẫu tiêm (dữ liệu không được hiển thị). Hình 4 cho thấy biểu đồ đỉnh cơ bản (Base Peak Chromatogram, BPC) và lớp phủ trình tự, được phân tích bằng cách sử dụng biểu đồ peptide mẫu dd EThcD MS2, Trypsin và AspN Enzyme Solution, cũng có thể đạt được độ bao phủ trình tự 100%, chứng minh rằng sự phân mảnh ETD/ETchD của máy đo khối phổ siêu phân giải Excedion Pro 2 trong 1 có thể tương thích với sắc ký lỏng tốc độ dòng chảy thông thường, thu được phổ thứ cấp chất lượng cao để phân tích biểu đồ peptide.

Hình 4. Biểu đồ peptide KADCYLA phân tích đỉnh cơ sở và độ phủ sóng trình tự, cả hai đều là chế độ thu thập dữ liệu dd ETchD MS2. Bên trái, mẫu enzyme Trypsin. Phải, mẫu enzyme AspN. Đối với các mẫu phân giải protease khác nhau, có thể đạt được phạm vi phủ sóng trình tự 100% cho mẫu đơn. (Click để xem ảnh lớn)

Như đã đề cập ở trên, thuốc kết nối KADCYLA (MCC-DM1) được kết nối với lysine bằng cách liên kết cộng hóa trị, và kết nối cũng xảy ra ở đầu N của trastuzumab, vì vậy đối với toàn bộ phân tử KADCYLA, có 92 vị trí kết nối tiềm năng, trong đó 46 vị trí không lặp lại (Hình 5). Vì lysine được cộng hóa trị sẽ tạo ra một trở ngại vị trí không gian sau khi nó được ghép nối, dẫn đến rò rỉ trypsin, quá trình phân giải enzyme trypsin sẽ tạo ra phân đoạn peptide ghép nối thuốc có chứa nhiều lysine, trong khi phân mảnh HCD sẽ phá vỡ bộ xương phân đoạn peptide và thuốc ghép nối cùng một lúc, dẫn đến việc không thể đánh giá chính xác vị trí ghép nối thuốc chỉ dựa trên phổ thứ cấp HCD. Và do cơ chế phân mảnh khác nhau, EThcD có thể giữ lại các nhóm kết nối thuốc trong khi phân mảnh bộ xương peptide, năng lượng phân mảnh phụ trợ HCD được tối ưu hóa có thể làm cho phân đoạn peptide phân mảnh đầy đủ hơn, đồng thời giữ lại mức độ tối đa của thuốc kết nối đầy đủ. Bảng 1 cho thấy việc sử dụng HCD và EThcD để phân mảnh mẫu enzyme Trypsin thứ cấp, tổng hợp thông tin về các vị trí kết nối thuốc thu được, trong số 46 vị trí sửa đổi tiềm năng, 43 vị trí được xác định là có sửa đổi thuốc, có thể nhìn thấy bằng cách sử dụng phân mảnh EThcD, đối với phân đoạn peptide chứa nhiều vị trí kết nối tiềm năng, vị trí kết nối có thể được xác định chính xác, kết hợp với kết quả HCD, có thể thu được thông tin đầy đủ và chi tiết về các vị trí kết nối.

Tất cả các vị trí biến đổi tiềm năng của phân tử KADCYLA, được đánh dấu bằng hộp màu đỏ trong chuỗi protein, có tổng cộng 92 vị trí, trong đó 46 vị trí không lặp lại.

(Click để xem ảnh lớn)

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

(Click để xem ảnh lớn)

Phông chữ màu đỏ, vị trí khớp nối. "++", các vị trí ghép nối có thể được xác nhận bằng ion phân mảnh thứ cấp. "+", sự kết hợp tồn tại trên phân đoạn peptide này, nhưng vị trí khớp nối cụ thể không thể được xác nhận bởi các ion phân mảnh. "-", chưa xác định được khớp nối.

Trượt xuống để xem tất cả

Khi enzyme KADCYLA được thực hiện với AspN, chuỗi nặng tạo ra một peptide phân đoạn D chứa ba lysine.K(216)K(217)VEPK(221)SC， Kết quả phân tích peptide của các mẫu enzyme trypsin cho thấy cả ba lysine này đều có thể được kết hợp. Connector MCC-DM1 của KADCYLA - Thuốc chứa một trung tâm đồng phân (Hình 6, trên cùng bên trái) khiến các phân đoạn peptide kết hợp thuốc được rửa sạch trên sắc ký ngược ở dạng parapeptide. Phân đoạn peptide D, như thể hiện trong Hình 6, do sự hiện diện của nhiều vị trí khớp nối tiềm năng và trung tâm đồng phân MCC-DM1K(216)K(217)VEPK(221)Sơ đồ dòng ion chiết xuất (Extract ion current – XIC) của SC thể hiện nhiều nhóm đỉnh. Nhờ vào phổ thứ cấp giàu thông tin được tạo ra bởi sự phân mảnh EThcD, người ta có thể xác định chính xác phân đoạn peptide được rửa trong thời gian lưu giữ khác nhau là vị trí nào đã xảy ra khớp nối (Hình 6, dưới) và tỷ lệ tương đối của mỗi sửa đổi có thể được tính toán dựa trên diện tích đỉnh XIC (Hình 6, trên bên phải).

Hình 6. Xác định vị trí khớp nối của các phân đoạn peptide có chứa nhiều vị trí khớp nối bằng EThcD. (Click để xem ảnh lớn)

Đối với các mẫu ADC, các sửa đổi sau dịch khác nhau liên quan đến chất lượng của thuốc cũng cần được mô tả và theo dõi, ngoài các vị trí ghép nối thuốc. Hình 7 cho thấy phân đoạn peptide FNWYViso dựa trên phổ phân mảnh thứ cấp EThcDD(283)Kết quả xác định đồng phân hóa aspartate của GVEVHNAK. Nhờ độ nhạy cao và độ chính xác chất lượng cao của nền tảng thiết bị, các ion c/z phong phú vẫn có thể được xác định ngay cả khi hàm lượng tương đối chỉ là 0,18% phân đoạn peptide không biến đổi, cũng như các ion c+57/z-57 đặc trưng được tạo ra bởi đồng phân hóa aspartic trong phân mảnh ETD, cho phép xác nhận đồng phân hóa aspartic. Kết quả định lượng tương đối có sẵn cho các sửa đổi sau dịch thuật phổ biến khác, chẳng hạn như khử amide, oxy hóa và glycosyl hóa, trong số những người khác (Hình 8).

Hình 7. Xác nhận đồng phân hóa aspartate bằng cách sử dụng phân mảnh EThcD. Các ion c+57/z-57 có thể được quan sát thấy trong biểu đồ phóng đại cục bộ bên dưới. (Click để xem ảnh lớn)

Hình 8. Các kết quả định lượng tương đối sau khi sửa đổi dịch thuật phổ biến khác, tất cả đều là trung bình mẫu lặp lại ba chân dd ETchD MS2. A, Quá trình oxy hóa methionine. B, Asparagine đã được khử. C, Asparagine succinimide hóa. D, Quá trình oxy hóa tryptophan. E, Chuỗi N-glycosyl hóa nặng. (Click để xem ảnh lớn)

Trượt xuống để xem tất cả

Tóm tắt

Bài viết này trình bày kết quả của các thí nghiệm đặc tính hóa ADC KADCYLA kết hợp lysine bằng cách sử dụng phổ khối phân giải cực cao 2 trong 1 thế hệ mới Excedion Pro BioPharma. Việc xác định trọng lượng phân tử đầy đủ của KADCYLA trong điều kiện không biến tính có thể đo được sự phân bố của số lượng khớp nối thuốc 0~8 trong điều kiện không khử đường và giá trị DAR trung bình thu được sau khi xử lý phần mềm là 3,47, phù hợp với báo cáo 3,5; Sự phân mảnh EThcD nhanh chóng và nhạy cảm không chỉ có thể đạt được phạm vi phủ sóng trình tự 100% của mẫu đơn, xác định sửa đổi sau dịch thuật phổ biến và định lượng tương đối, mà còn xác định vị trí khớp nối, xác định axit amin đồng phân, v.v. để cung cấp kết quả đáng tin cậy cho việc mô tả toàn diện các phân tử sinh học phức tạp.

Tài liệu tham khảo:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Thuốc phối hợp kháng thể: "tên lửa sinh học" cho liệu pháp ung thư nhắm mục tiêu. ^ Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

[3] Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Khánh thể-thuốc kết hợp: Thứ kỷ qua. Dược phẩm 2020, 13, 245.

Nếu cần hợp tác tải lại bài viết này, xin vui lòng để lại lời nhắn cuối bài viết.