Một,Dụng cụ PCR hoàn toàn tự độngChuẩn bị trước khi hoạt động
Chuẩn bị thuốc thử và vật tư tiêu hao
Thuốc thử: bao gồm mẫu DNA, mồi cụ thể (chuyển tiếp và đảo ngược), dNTP (bốn deoxyribonucleotide), DNA polymerase chịu nhiệt độ cao (ví dụ như enzyme Taq), dung dịch đệm và dung dịch ion Mg². Tất cả các thuốc thử cần được trộn đều sau khi tan chảy hoàn toàn, tránh sai số nồng độ.
Vật tư tiêu hao: Sử dụng ống PCR vô trùng dùng một lần hoặc tấm 96 lỗ để đảm bảo độ kín tốt và ngăn ngừa ô nhiễm chéo.
Hoạt động phân vùng: Hoàn thành công thức hệ thống trong khu vực chuẩn bị tác nhân (bàn làm việc siêu sạch hoặc tủ an toàn sinh học), đeo găng tay và tránh nói chuyện trong khi vận hành, giảm ô nhiễm bình xịt.
Kiểm tra dụng cụ
Xác nhận rằng máy PCR được đặt trên nền tảng chắc chắn ngang, điện áp nguồn phù hợp và nối đất tốt.
Kiểm tra xem khe mẫu có sạch không và tránh dư lượng ảnh hưởng đến độ dẫn nhiệt độ.
Thường xuyên rửa bể mẫu bằng nước xà phòng, cấm sử dụng kiềm mạnh, nồng độ cồn cao hoặc dung môi hữu cơ.
II. Xây dựng hệ thống phản ứng
Thuốc thử hỗn hợp
Mẫu DNA, mồi, dNTP, DNA polymerase, dung dịch đệm và dung dịch Mg²⁺ được thêm vào ống ly tâm vô trùng theo tỷ lệ với dung tích ổn định của hơi kép vừa phải đến thể tích cuối cùng (15-50 μL được khuyến nghị).
Thông số chính:
Chất lượng mẫu DNA: Tránh làm suy thoái hoặc ô nhiễm chất ức chế, nếu không sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại.
Thiết kế mồi: Đảm bảo tính đặc hiệu, tránh dimer hoặc cấu trúc tự bổ sung, nhiệt độ ủ cần phù hợp với giá trị mồi Tm.
Nồng độ Mg²⁺: quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme và cần được điều chỉnh theo hướng dẫn sử dụng thuốc thử.
Hệ thống lắp ráp
Nhanh chóng đổ chất lỏng hỗn hợp vào ống PCR, đóng nắp ống hoặc phủ màng đặc biệt, ly tâm ngắn (1000-2000rpm, 1 phút) cho phép chất lỏng chìm xuống đáy ống.
III. Thiết lập chương trình PCR
Thông số chương trình nhiệt độ
Biến tính ban đầu: 94-98 ℃, 20-30 giây, cho phép tách hoàn toàn chuỗi đôi DNA.
Biến tính tuần hoàn: 94-98 ℃, 20-30 giây, duy trì trạng thái chuỗi đơn.
Ủ: 50-65 ℃, 20-40 giây, mồi kết hợp cụ thể với khuôn mẫu (nhiệt độ ủ cần được tối ưu hóa bằng gradient PCR).
Mở rộng: 72 ℃, 1 phút/kb đoạn DNA, Taq enzyme tổng hợp chuỗi mới.
Số vòng lặp: 20-40 lần, điều chỉnh theo sự phong phú của đoạn mục tiêu.
Phần mở rộng cuối cùng: 72 ℃, 5-10 phút, đảm bảo tất cả các phần mở rộng hoàn toàn.
Nhiệt độ bảo quản: 16 ℃, 2 phút (tránh tiêu hao quá mức của máy nén, cấm thiết lập để 4 ℃ bảo quản vô thời hạn).
Cài đặt chức năng nâng cao
Gradient nhiệt độ: Đặt gradient nhiệt độ (chẳng hạn như 50-65 ℃) ở bước ủ, kiểm tra nhiều nhiệt độ ủ cùng một lúc, tối ưu hóa điều kiện thử nghiệm.
Tốc độ tăng nhiệt (Ramp Rate): Điều chỉnh tốc độ tăng/giảm nhiệt (ví dụ: 3°C/s) để giảm thời gian phản ứng.
Tăng chu kỳ (Increment): Tăng nhiệt độ hoặc thời gian sau mỗi chu kỳ (ví dụ: tăng 0,1 ° C mỗi chu kỳ), thích hợp cho các thí nghiệm đặc biệt như Touchdown PCR.
Chương trình Save&Run
Lưu lại sau khi nhập tên chương trình, đặt ống PCR vào khe mẫu, đóng nắp nóng và vặn chặt.
Khởi động chương trình, nhiệt độ và thời gian có thể được theo dõi trong thời gian thực thông qua màn hình trong quá trình chạy, hỗ trợ tạm dừng, bỏ qua các bước hoặc chấm dứt chương trình.
IV. Xử lý sau thí nghiệm
Phân tích sản phẩm
Ống PCR được lấy ra ngay sau khi phản ứng kết thúc và kích thước và nồng độ sản phẩm được phân tích bằng điện di gel agarose hoặc phát hiện huỳnh quang, chẳng hạn như SYBR Green.
Nếu sử dụng phương pháp đánh dấu huỳnh quang, bạn cần đảm bảo rằng các thông số của thiết bị (chẳng hạn như bước sóng kích thích, giá trị tăng) phù hợp với thuốc thử và tránh nhiễu tín hiệu nền.
Bảo trì dụng cụ
Trước khi tắt thiết bị, mô-đun được làm nóng được làm mát tự nhiên đến nhiệt độ phòng để ngăn ngừa thiệt hại do căng thẳng nhiệt.
Hiệu chỉnh cảm biến nhiệt độ thường xuyên để đảm bảo độ chính xác nhiệt độ (chẳng hạn như sử dụng chất hiệu chuẩn điểm nóng chảy tiêu chuẩn).
Làm sạch khe mẫu và nắp nóng, kiểm tra xem vòng đệm có bị lão hóa hay không, thay thế kịp thời các bộ phận bị mất.
Năm,Dụng cụ PCR hoàn toàn tự độngLưu ý
Kiểm soát ô nhiễm
Toàn bộ quá trình thí nghiệm tuân theo nguyên tắc "không có axit nucleic", sử dụng pipet đặc biệt, đầu súng và quần áo làm việc để tránh ô nhiễm chéo.
Thiết lập đối chứng âm tính (không có khuôn mẫu) và đối chứng dương tính, giám sát độ tin cậy của hệ thống thí nghiệm.
Hoạt động an toàn
Tránh mở nắp nóng trong khi máy PCR đang hoạt động và ngăn ngừa bỏng nhiệt độ cao hoặc bốc hơi mẫu.
Cấm sử dụng chất lỏng ăn mòn để làm sạch dụng cụ và ngăn ngừa thiệt hại cho các linh kiện điện tử.
Xử lý sự cố
Không có sản phẩm khuếch đại: kiểm tra chất lượng mẫu, thiết kế mồi hoặc các thông số chương trình (chẳng hạn như nhiệt độ ủ quá cao).
Dải không đặc hiệu: Tối ưu hóa nhiệt độ ủ hoặc tăng thời gian kéo dài, giảm sự hình thành dimer.
Biến động nhiệt độ: liên hệ với kỹ sư để hiệu chỉnh dụng cụ và đảm bảo tính đồng nhất nhiệt độ phù hợp với tiêu chuẩn (ví dụ: ± 0,2 ℃).