Ước tính số lượng EV, xác định sự hiện diện của EV và đánh giá tỷ lệ và tác động của các thành phần không phải EV trong việc chuẩn bị EV, v.v., đòi hỏi phải mô tả EV. Đặc tính của EV phải đối mặt với những thách thức về kích thước hạt nhỏ, không đồng nhất kích thước và không đồng nhất phân tử, thiếu các phương pháp nhận dạng EV phổ biến và không đặc hiệu EV của nhiều kỹ thuật đo lường.Không có phép đo hoặc phương pháp nào có thể đáp ứng tất cả các yêu cầu về đặc tính EV, vì vậy nên xác minh lẫn nhau bằng phương pháp trực giao (tức là phương pháp không có giới hạn đo giống nhau).Điều đó có nghĩa là các tham số đặc trưng của EV được khuyến nghị như là thuộc tính chất lượng chính (CQA) để phát hiện cùng một chỉ số bằng cách sử dụng hai hoặc nhiều nguyên tắc khác nhau.
Thành phần tổng thể của EV (hàm lượng và tỷ lệ protein, lipid, axit nucleic và các phân tử sinh học khác, v.v.) khác nhau tùy thuộc vào nguồn EV. Mặc dù các phép đo của các loại phân tử riêng lẻ này có thể được sử dụng để ước tính sự phong phú của EV, các giá trị này không nhất thiết phải liên quan đầy đủ đến nồng độ EV và không có sự phổ biến giữa các vật liệu nguồn; Vì vậy,Chúng không nên được sử dụng làm thước đo nồng độ EV.Cũng giống như không có phát hiện phân tử đơn lẻ nào có thể định lượng tất cả EV, cũng không có dấu hiệu phân tử chung cho các phân nhóm EV hoặc EV. Các dấu hiệu cụ thể phải được chọn dựa trên bằng chứng về tính cụ thể của nguồn và loại. Hiện tại,Không có dấu hiệu chung nào được biết đến để xác định tất cả EV, bất kể nguồn gốc của chúng.Đối với cái gọi là exosome, sự phổ biến của các dấu hiệu này là không rõ ràng hoặc không được chấp nhận. Lưu ý rằng phác đồ dựa trên ái lực liên quan đến bốn protein xuyên màng CD9, CD63 và CD81 không đặc hiệu đối với exosome là phân nhóm EV; Các quần thể EV sử dụng kháng thể làm giàu chống lại một trong bốn protein xuyên màng này không thể không bao gồm toàn bộ thành phần phân tử. Ngoài ra, không phải tất cả EV đều biểu hiện các dấu ấn protein này, vì vậy bốn lần làm giàu protein xuyên màng không bắt được tất cả EV.Phương pháp trực giao để phát hiện cùng một tham số đặc trưng(Có nhiều hơn một nguyên tắc)Không có khả năng có cùng độ lệch; Ví dụ, đường kính của EV được suy ra và phát hiện riêng biệt bằng phương pháp quang học và không quang học cùng một lúc.Việc sử dụng phương pháp trực giao để mô tả mẫu EV cũng rất quan trọng để chứng minh rằng các chất đồng phân lập không liên quan đến các dấu ấn sinh học hoặc khám phá chức năng.Vì nhiều phương pháp mô tả EV không phù hợp cụ thể với EV hoặc không thể phát hiện tất cả EV, các phương pháp và kết quả cần được công bố minh bạch để đảm bảo tính lặp lại của dữ liệu EV.
I. Định lượng nồng độ hạt
Số lượng và thể tích đo EV cùng nhau xác định nồng độ số (trong particles/mL), một chỉ số được báo cáo rộng rãi và được sử dụng. Tuy nhiên, nó thường không đáng tin cậy vì nhiều kỹ thuật thiếu tính đặc hiệu và nhạy cảm với EV.Nhóm làm việc về vật liệu tham chiếu EV nghiêm ngặt và tiêu chuẩn hóa của ISEV gần đây đã phác thảo các cân nhắc về kỹ thuật đo lường và những thách thức mà lĩnh vực này phải đối mặt khi đối mặt với các phép đo truy xuất nguồn gốc, phát triển và báo cáo các đặc tính tốt của EV. Một điểm nổi bật quan trọng của công việc này là sự cần thiết phải công bố LOD của phương pháp phát hiện, do đó cho phép người khác xác minh kết quả bất kể giới hạn độ nhạy.Độ tin cậy của đo nồng độ EV có thể được tăng lên bằng cách sử dụng phương pháp trực giao，Mỗi phương pháp có LOD xác định, chẳng hạn như phát hiện cường độ tán xạ ánh sáng(như NTA), cường độ huỳnh quang(như FCM)Kích thước vật lý(như RPS),Bởi vì phương pháp trực giao không có cùng giới hạn đo lườngVí dụ, công nghệ cảm ứng xung điện trở (RPS) có thể được sử dụng để biểu thị LOD với kích thước hạt. Đối với các kỹ thuật quang học như Floodcytomy, LOD có thể được báo cáo bằng đường kính có nguồn gốc từ mô hình quang học tán xạ ánh sáng hoặc bằng các phân tử huỳnh quang hòa tan tương đương (MESF) có nguồn gốc từ cường độ huỳnh quang. Những phương pháp này có thể tạo ra dữ liệu nhất quán giữa các dụng cụ và độ nhạy khác nhau. Do có nhiều biến số liên quan đến việc phát hiện hạt, nênHiện tại không có phương pháp phân tích theo dõi hạt nano (NTA), tán xạ ánh sáng động (DLS))Hoặc hình ảnh tế bào dòng chảy để truy nguyên LOD。Đối với các kỹ thuật không thể phân biệt EV với các chất đồng phân lập hoặc chất gây ô nhiễm tiềm năng khác, báo cáo nồng độ được khuyến nghị thể hiện dưới dạng "nồng độ hạt hoặc nồng độ EP" thay vì "nồng độ EV", bất kể các bước tách ngược dòng.
II. Định lượng kích thước hạt
Các phép đo kích thước EV (tính bằng bán kính nano hoặc đường kính) dựa trên các giả định như độ cầu hoặc độ di chuyển và kết quả đầu ra có thể bị ảnh hưởng bởi các biến ngược dòng. Phương pháp thông lượng cao thông thường, bao gồm tế bào lưu thông, NTA、RPS、 Cả tán xạ ánh sáng đa góc và tán xạ ánh sáng động (DLS) đều giả định EV là hình cầu. Mặc dù "kích thước" và "đường kính" thường được sử dụng kết hợp giữa các phương pháp đo lường, cách chúng được suy ra cũng có thể dẫn đến sự khác biệt nhất quán giữa các kỹ thuật đo lường. Ví dụ,Các kỹ thuật phụ thuộc vào chuyển động của hạt Brown, chẳng hạn như NTA hoặc DLS, đo đường kính thủy động lực học, dẫn đến ước tính kích thước hạt quá cao so với các phương pháp hình ảnh như gương đông lạnh.Và có rất ít cách để đo chính xác kích thước EV trên toàn bộ phạm vi đường kính có thể của EV, từ vài chục nanomet đến micron. Ví dụ, trong khi hình ảnh có độ phân giải cao của cryoscope là một trong những phương pháp chính xác nhất, nó có thông lượng phát hiện tương đối thấp và nhiều EV lớn hơn có xu hướng ít hơn và có thể không định lượng được. Khả năng định lượng EV có độ tương phản thấp dưới 100 nm cũng có thể là một yếu tố hạn chế.
Khi ngày càng có nhiều nhà nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật phân tích hạt đơn chuyên dụng với độ nhạy cao hơn, ngày càng rõ ràng rằng nhiều chế phẩm EV thể hiện sự phân bố lệch phải không đối xứng, chẳng hạn như phân phối bình thường logarit, trong đó hầu hết EV có đường kính<100 nm. Hầu hết các kỹ thuật phân tích hạt đơn không thể phân tích toàn bộ quần thể EV, vì vậyCác nhà nghiên cứu nên chia sẻ phân phối đường kính EV được phát hiện，Không chỉ là các chỉ số tổng hợp như kích thước trung bình, kích thước tập trung hoặc kích thước giá trị trung bìnhCác chỉ số này có thể dễ dàng bị nghiêng do LOD và phân bố kích thước không đối xứng. Xin lưu ý,Thống kê kích thước phù hợp, chẳng hạn như đo các hạt chiết suất thấp thông qua NTA, có thể gần với LOD của thiết bị hơn là đường kính phương thức thực của quần thể EV.Sử dụng phần mềm với các thuật toán độc quyền để xác định kích thước hạt cũng có thể dẫn đến sự khác biệt giữa các phiên bản phần mềm hoặc nền tảng phần mềm, vì vậy phần mềm và phiên bản của nó cũng nên được cung cấp.Kỹ thuật suy ra kích thước từ giả thuyết chiết suất có thể thay đổi do thành phần mẫu khác nhau và tảiKích thước thu được từ đầu dò huỳnh quang (ví dụ, thuốc nhuộm nhúng màng) có thể thay đổi do nhúng thuốc nhuộm khác nhau dựa trên thành phần mỡ màng khác nhau. Đối với các kỹ thuật không thể phân biệt EV với các chất đồng phân lập/chất gây ô nhiễm, bất kể các bước tách ngược dòng, nên xây dựng báo cáo đường kính dưới dạng đường kính "hạt" hoặc "EP" thay vì "đường kính EV".
B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)
Khi việc sử dụng các thí nghiệm và dụng cụ phát hiện EV và kiến thức chuyên môn được mở rộng, việc xác định quy mô báo cáo đặc tính liên quan cũng tăng lên để đảm bảo độ tin cậy và tính lặp lại của dữ liệu. Hướng dẫn MISEV2023 cung cấp một danh sách chi tiết các cân nhắc cho các thí nghiệm tối thiểu và báo cáo cụ thể của thiết bị. Những điều này thường được áp dụng bất kể thiết kế thử nghiệm. Các kỹ thuật được liệt kê ở đây không đầy đủ và nhiều kỹ thuật phát hiện đang được phát triển hoặc đang được nghiên cứu tích cực. Tuy nhiên, các kỹ thuật được liệt kê đều có sẵn về mặt thương mại và có tài liệu được công bố từ nhiều nhà nghiên cứu. (Do hạn chế về độ dài, tác giả ở đây chỉ liệt kê mô tả và quan điểm chính của một số công cụ mô tả kích thước hạt và nồng độ EV thường được sử dụng.)[Flow Cellome dựa trên microbeads]ISEV khuyến cáo rằng nhóm kiểm soát nên bao gồm các vi hạt giống nhau hoạt động như kháng thể phát hiện, hoặc các vi hạt bị mắc kẹt trong các khớp nối giống nhau, và các vi hạt bị mắc kẹt chỉ chứa kháng thể phát hiện (đối với các hạt bị mắc kẹt trong các gói kháng thể); Nên sử dụng nhiều nồng độ trên EV để hiển thị chuẩn độ của tín hiệu; Nếu microbead được chuẩn bị, các tác nhân và thành phần hóa học của chúng nên được công bố; Danh mục và số lô thuốc thử vi hạt thu được thương mại cũng nên được công bố; Công bố giá trị cường độ huỳnh quang trung bình của microbead tiêu chuẩn hóa; Công bố dữ liệu và thống kê giá trị cường độ huỳnh quang trung bình từ các phân tử huỳnh quang hòa tan tương đương (MESF) từ các vi hạt khoanh tròn đơn trạng thái (như trong tế bào dòng EV đơn); Phương pháp luận đầy đủ và chi tiết cần được công bố. Động tác Balanced force technique (Năm 2023, thông qua sáng kiến của Nhóm làm việc ba xã hội (Nhóm làm việc về tế bào dòng EV), bao gồm Hiệp hội quốc tế về túi ngoài tế bào (ISEV), Hiệp hội quốc tế về tiến bộ đếm tế bào, Hiệp hội quốc tế về huyết khối và cầm máu, đã xuất bản Bản tóm tắt về tế bào dòng đơn EV để giải quyết toàn diện các cân nhắc trong việc phát triển các xét nghiệm tế bào dòng đơn EV.Hiệu chuẩn khối lượng mẫu, các thông số huỳnh quang và tán xạ ánh sáng là rất quan trọng để giải thích và sao chép kết quả luồng EV đơn. Nếu nồng độ hạt được báo cáo bằng máy đo tế bào dòng EV đơn, hãy xác định giới hạn trên và dưới của LOD để cho phép lặp lại và xác minh kết quả bằng phương pháp trực giao hoặc người khác.Hiện tại, các tế bào kế hình ảnh sử dụng phương pháp kích hoạt động, khiến việc xác định LOD thấp hơn khó xác định và do đó khó tiêu chuẩn hóa.DLS， Còn được gọi là quang phổ liên quan đến photon (PCS) và tán xạ ánh sáng gần như đàn hồi (QELS), là một kỹ thuật cho phép xác định đường kính thủy động lực học của các hạt phân tán đơn đủ trong dung dịch nước pha loãng. DLS đo lường một chức năng tự tương quan của cường độ laser phân tán bởi nhiều hạt trong dung dịch. Hàm tự tương quan mang thông tin về hệ số khuếch tán hạt tương quan với đường kính thủy động lực học thông qua lý thuyết chuyển động Stokes-Einstein Brown.Hệ số khuếch tán có thể được lấy từ các hàm tự tương quan đo được bằng cách sử dụng nhiều thuật toán. Phương pháp phổ biến nhất là phân tích khối lượng tích lũy, nhưngNó giả định rằng tất cả các mẫu đều là phân bố kích thước đơn phân tán, trong khi các mẫu EV thì không.. Đối với phân bố kích thước đa phân tán của mẫu EV, phân bố hệ số của các hàm tương quan có nguồn gốc từ khuếch tán trở thành một vấn đề toán học khó chịu. Nghĩa làDLS không nên được sử dụng để xác định các thuộc tính định lượng của mẫu EVTrừ khi DLS được áp dụng cho một phần của EV có kích thước phân tán đơn. Mặt khác, DLS có thể được sử dụng để xác nhận định tính sự hiện diện của các hạt phụ micron và các cụm có thể có trong mẫu EV.Kính hiển vi điện tử (EM) là một trong số ít các công nghệ có thể phát hiện EV (bất kể kích thước). Tuy nhiên, thông lượng của gương điện cũng có nghĩa là EV lớn hơn sẽ bị đánh giá thấp về mặt thống kê so với EV nhỏ hơn. SEM, TEM và Cryo-EM là tất cả các phương pháp mô tả EV có độ phân giải cao và chúng không phải chuyển đổi với nhau hoặc có thể cung cấp hình ảnh có chất lượng tương đương. Ví dụ,Cryo-EM có thể hiển thị rõ ràng cấu trúc hai lớp lipid, duy trì hình thái EV tốt hơn so với điều kiện mất nước TEM sử dụng để cố định mẫu và có thể định lượng chính xác hơn (kích thước),Bởi vì tất cả các hạt trong một thể tích nhất định có thể được chụp ảnh, không chỉ những hạt bám vào bề mặt lưới mang.Các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa về phương pháp EM được thực hiện để xác định các yêu cầu báo cáo thấp là rất hạn chế. Đối với TEM, ba thông số chính cần được công bố: phương pháp nhuộm cố định, hấp phụ và tiêu cực. Cố định bao gồm: chất cố định được sử dụng và nồng độ và thời gian ủ; Hấp phụ bao gồm vật liệu mang lưới, kích thước mang lưới, loại màng, lớp phủ, thời gian ủ và chi tiết làm sạch; Chi tiết về nhuộm âm tính nên bao gồm chất nền, nồng độ và thời gian ủ. Và, các tiêu chí lựa chọn hình ảnh có độ phóng đại thấp và cao cũng như hình ảnh nên được công bố.[Phân tích theo dõi hạt nano]NTA， Cũng được coi là một loại theo dõi hạt đơn, nó là một kỹ thuật quang học được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực EV để ước tính kích thước và nồng độ hạt. NTA thường sử dụng các thuật toán làm giảm sự thay đổi trong phân bố đường kính để tạo ra đường kính thủy động lực học bằng cách đo hệ số khuếch tán của các hạt. Điều đáng chú ý là,Thuật toán FTLA được sử dụng trên một số thiết bị NTA đã được phát triển để đại diện tốt hơn cho hỗn hợp phân tán đơn, trong khi EV thì không, điều này có thể dẫn đến nhiều phân phối phù hợp nhân tạo.. Và, hiện tại, không có cách nào để xác định hoặc công bố LOD được thiết lập bởi NTA. Nhiều học giả đã thực hiện một số nghiên cứu tiêu chuẩn để so sánh kết quả giữa người dùng và thiết bị.Việc sử dụng NTA để đo sự phân bố đường kính và nồng độ của các mẫu chất lỏng sinh học phức tạp cần được giải thích một cách thận trọng.bởi vì nó đếm các chất đồng phân lập như lipoprotein và phức hợp protein lớn, vàNTA gặp khó khăn trong việc định lượng EV trên vài trăm nanomet。Đối với thông tin được công bố của NTA, cần bao gồm mô hình thiết bị, loại máy ảnh, cài đặt máy ảnh, bước sóng laser, công suất laser, phiên bản phần mềm, cài đặt phân tích và hạt trên mỗi khung hình. Nếu biết thìCác thuật toán được sử dụng để tạo ra phân phối đường kính nên được xuất bản vì các kết quả khác nhau có thể được tạo ra tùy thuộc vào thuật toán được sử dụng.Trong trường hợp tán xạ ánh sáng hoặc chế độ phát hiện huỳnh quang, nên sử dụng bộ đệm trống làm kiểm soát. Đối với NTA huỳnh quang, tổng số hạt ở chế độ tán xạ ánh sáng và số hạt được đánh dấu ở chế độ huỳnh quang được báo cáo, cũng như phương pháp loại bỏ đánh dấu và kiểm soát chất đệm/thuốc thử để đánh giá tình trạng giả màu của nhãn hiệu.Nếu một thiết bị giống chất lỏng được sử dụng cũng nên công bố cài đặt của nó。Đây là lần đầu tiên MISEV sử dụng công nghệ cảm biến xung điện trở (RPS) như một phương pháp mô tả hạt EV thường được đề xuất bên cạnh các phương pháp dựa trên dòng chảy (bao gồm dòng chảy dựa trên microbead và dòng EV đơn) và các phương pháp dựa trên kính hiển vi (bao gồm kính hiển vi lực nguyên tử, gương điện, DLS, NTA, kính hiển vi siêu phân giải, v.v.). Đây cũng là một trong số ít các kỹ thuật mô tả EV cho các nguyên tắc phi quang học.RPS sử dụng nguyên tắc Kurt để xác định nồng độ và đường kính của các hạt, và một số thiết bị cũng có tiềm năng zeta. Hiện tại RPS có đường kính LOD thấp đến ∼50 nm. Tài liệu báo cáo,RPSKết quả đo lường thực sự liên quan đếnTập đoàn TEMDữ liệu có tính thống nhất rất cao.Khi dữ liệu RPS được báo cáo, nên xuất bản mẫu thiết bị, khẩu độ, đường kính và nguồn microbead hiệu chuẩn và phiên bản phần mềm. Như đã đề cập trước đó (định lượng kích thước hạt), đối với dữ liệu EV,Đề nghị công bố phân phối đường kính của RPS thay vì thống kê đường kính đơn lẻ. Và nên kết hợp kiểm soát bộ đệm trống để xác định nền, và các mẫu sau khi tách chất khử nhiễm có nồng độ tương tự để xác định sự kiện đánh dấu. Vì công nghệ RPS có thể dễ dàng bị chặn bởi các hạt lớn hơn, các bước trước khi phân tích như ly tâm hoặc lọc có thể được sử dụng để loại bỏ các hạt lớn hơn. Vì các phương pháp này có thể thay đổi nhóm EV đang được phân tích và ảnh hưởng đến việc so sánh với các phương pháp trực giao, bất kỳ quy trình tiền phân tích nào cũng cần được nêu rõ.(Phương pháp in dấu protein)Yêu cầu cung cấp thông tin chi tiết về làm giàu protein và định lượng; Nếu có thể, cần bao gồm kiểm soát dương tính và âm tính của kháng nguyên; Nếu protein được cho là có liên quan đến EV, cần phải bao gồm các phép đo độ tinh khiết của các chế phẩm EV. Báo cáo tất cả các chi tiết (bao gồm nhưng không giới hạn ở thông tin kháng thể, điều kiện thoái hóa và giảm mẫu, phương pháp chuyển màng, loại màng, bộ đệm và thiết bị và thông số hình ảnh) về mẫu chuẩn hóa, điện di gel, phương pháp chuyển màng, phương pháp chuyển màng, thiết bị và thông số hình ảnh; Cung cấp tất cả các hình ảnh không cắt xén của WB (nếu được công bố trên tạp chí, cần phải được bổ sung).Trong các phần trên, hướng dẫn thảo luận về các phương pháp khác nhau để mô tả EV riêng biệt và đưa ra các khuyến nghị cụ thể. Bất kể phương pháp nào được sử dụng, các khuyến nghị tổng thể để mô tả được tóm tắt như sau:
- Mỗi công thức EV nên được xác định bằng các phép đo định lượng nguồn EV (ví dụ: số lượng tế bào tiết, thể tích chất lỏng sinh học, khối lượng mô, v.v.).
- Sự phong phú của EV (bao gồm số lượng hạt, protein và/hoặc hàm lượng lipid) nên được ước tính.
- Công thức EV nên được kiểm tra sự hiện diện của các thành phần liên quan đến phân nhóm EV hoặc EV, tùy thuộc vào độ đặc hiệu cần thiết cho mục đích thử nghiệm.
- Xác định mức độ hiện diện của các thành phần không nang, đồng phân lập.
- Khi sử dụng các chỉ số định lượng để mô tả EV, cần cung cấp giới hạn phát hiện (LOD) cho thiết bị hoặc phương pháp.
