Hiệu ứng ma trận là khi các chất khác trong mẫu có thể có ảnh hưởng đến khả năng phát hiện chất phân tích mục tiêu, phổ biến nhất trong các xét nghiệm miễn dịch trên các mẫu sinh học như huyết thanh, huyết tương, cân bằng mô, v.v., vì nhiều thành phần trong loại mẫu này như carbohydrate, protein, phospholipid, chất chuyển hóa, v.v. can thiệp vào sự liên kết của kháng thể với mục tiêu của nó, hoặc ức chế hoặc tăng cường tín hiệu, ảnh hưởng đến định lượng chính xác của chất phân tích [1].

Rối loạn ma trận thậm chí còn là một thách thức lớn hơn trong phân tích sinh học của các nghiên cứu lâm sàng, chẳng hạn như nhiều loại rối loạn đã được tìm thấy trong huyết thanh và huyết tương, thường là các chất nội sinh như yếu tố thấp khớp, kháng thể dị tính (kháng thể được tạo ra chống lại kháng nguyên không xác định, thể hiện ái lực thấp và liên kết yếu), kháng thể kháng động vật của con người (HAAA, kháng thể ái lực cao được tạo ra khi hệ thống miễn dịch tiếp xúc với kháng thể động vật) và các protein huyết tương khác như albumin, lysozyme, fibrinogen, v.v. [1] ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy, đặc hiệu và biến thể của phát hiện, dẫn đến định lượng phân tích không chính xác.

Cách cơ bản nhất để giảm hiệu ứng ma trận là pha loãng mẫu, nhưng chỉ khi mức độ phân tích sau khi pha loãng vẫn nằm trong phạm vi tuyến tính và pha loãng ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện, vì vậy nó không phải là một chiến lược chung. Tối ưu hóa pH đệm và cường độ ion cũng có thể giúp giảm các tương tác không cụ thể. Các chiến lược khác để khắc phục sự can thiệp bao gồm thêm các chất liên kết hoặc cạnh tranh với các phân tử can thiệp, chẳng hạn như loại bỏ thụ động kháng thể chống chuột của con người (HAMA) bằng cocktail huyết thanh động vật thích hợp, sử dụng các chất ức chế kháng thể dị tính như thuốc thử chặn dị tính (HBR) và thuốc thử ức chế globulin miễn dịch (IIR), hoặc F (ab′) 2 hoặc mảnh chuỗi đơn (scFv) thiếu các mảnh Fc làm thuốc thử bắt/phát hiện, v.v. [1] Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp này đều tốn nhiều công sức và tốn kém và không thực tế cho các nghiên cứu về kích thước mẫu lớn.

Đối với xét nghiệm miễn dịch dựa trên thử nghiệm liên kết ligand (LBA), việc giảm thời gian ủ hoặc thời gian phát hiện sự tiếp xúc của thuốc thử với ma trận đã được chứng minh là một trong những phương tiện hiệu quả để khắc phục hiệu ứng ma trận.Gyrolab ® Một mô hình dòng chảy cột ái lực được thực hiện trên đĩa CD được điều khiển vi lưu, do đó giảm thiểu thời gian tiếp xúc của tác nhân với ma trận, giảm thiểu nhiễu ma trận.Shannon D Chilewski et al.[5] Sử dụng Gyrolab ® Nền tảng giải quyết vấn đề nhiễu ma trận trong nghiên cứu PK tiền lâm sàng.

Trường hợp này là sự can thiệp ma trận có nguồn gốc từ kháng thể chống động vật của con người (HAAA) đã được quan sát thấy trong các thử nghiệm PK trên một kháng thể PEG hóa nhất định. Trong giai đoạn phát hiện thuốc, phương pháp phát hiện được sử dụng để hỗ trợ nghiên cứu liều đơn tăng dần (SDA) là phương pháp dựa trên phát hiện phát quang điện hóa (ECL), với các phân tử mục tiêu làm thuốc thử bắt, kháng thể kháng Vk dê làm thuốc thử, độ pha loãng mẫu là 50 lần và giới hạn dưới định lượng LLOQ là 80 ng/mL.

Nhưng khi quá trình chuyển đổi từ giai đoạn phát hiện sang giai đoạn phát triển đòi hỏi độ nhạy phát hiện thấp hơn và đồng thời duy trì hoặc cải thiện độ chính xác và độ chính xác, và LLOQ của phương pháp phát hiện ECL 80ng/mL không còn phù hợp để hỗ trợ giai đoạn tiếp theo của nghiên cứu vì ba lý do:

1 Nhóm phát triển quan tâm đến đặc điểm chu kỳ bán hủy của thuốc ở liều thấp hơn và nếu các phương pháp thử nghiệm hiện tại được tuân theo, kết quả sẽ

2. mong muốn đo nồng độ thuốc trong chu kỳ với EC50 là 78ng/mL;

3 Trong trường hợp có tính miễn dịch, kháng thể kháng thuốc có thể có tác dụng làm sạch thuốc, làm giảm nồng độ thuốc trong lưu thông, do đó suy ra rằng xét nghiệm này sẽ hạn chế hơn nữa số lượng thuốc ở liều thấp hơn.

　Để tăng độ nhạy phát hiện và mở rộng LLOQ lên 30ng/mL được yêu cầu, nhóm nghiên cứu đã khám phá việc áp dụng Gyrolab ® Nền tảng và kết hợp thuốc thử mới để nhanh chóng phát triển các phương pháp phát hiện mới trong thời gian giới hạn.

Đầu tiên tại Gyrolab ® Sự kết hợp của các tác nhân bắt và phát hiện đã được sàng lọc ở trên, với kháng thể kháng thuốc đa dòng ở dê làm tác nhân bắt và kháng mumab đặc biệt ở chuột làm tác nhân thử nghiệm, sự kết hợp này cho thấy hiệu suất tối ưu với nồng độ kháng thể bắt là 100 µg/mL và nồng độ kháng thể phát hiện là 2500ng/mL. Sử dụng Gyrolab ® Bioaffy 200 CD (khối lượng mẫu 200nL) và Gyrolab tiêu chuẩn ® Phương pháp ba bước (chụp - phân tích - phát hiện) được phân tích với MRD pha loãng mẫu là 2.

PBS-T hoạt động như một bộ đệm pha loãng (PBS+1% BSA+0,05% Tween-20), pha loãng mẫu 2 lần. 6 CD test trong 3 ngày Mỗi đĩa CD bao gồm một đường cong tiêu chuẩn và 4 lần lặp lại của 6 mẫu QC cấp. Phạm vi đường cong tiêu chuẩn là 30-2000ng/mL và điểm neo là 2500ng/mL. Mẫu QC được pha loãng 125 lần trong huyết thanh người 100% và sau đó pha loãng 2 lần với bộ đệm phát hiện để nồng độ rơi vào phạm vi xác định. Bảng 1 cho thấy tất cả các kết quả có độ chính xác và độ chính xác phát hiện tốt.

Các mẫu được pha loãng với bộ đệm PBS-T và bộ đệm Rexxip H (Gyros) được cấp bằng sáng chế của Gyros được so sánh song song. Do thử nghiệm có chứa mumab chuột, kháng thể chống chuột của con người HAMA là nguồn gây nhiễu tiềm năng và bộ đệm Rexxip H chứa các thành phần trung hòa kháng thể dị tính, nên pha loãng với Rexxip H sẽ ức chế tín hiệu nhiễu ma trận.

20 mẫu huyết thanh (NHS1-10 huyết thanh cho 10 người bình thường và DPS1-10 huyết thanh cho 10 người bị bệnh) được phân tích bằng cách pha trộn thuốc ở nồng độ 30 ng/mL, và tất cả 20 mẫu cũng được phân tích không đạt tiêu chuẩn. Tiêu chí chấp nhận: 80% mẫu bổ sung cần được thu hồi trong phạm vi sai lệch nồng độ danh định ± 25%, và tất cả các mẫu không được đánh dấu phải được thu hồi dưới LLOQ. Kết quả (Bảng 2) cho thấy mẫu huyết thanh của người bình thường đáp ứng các tiêu chí chấp nhận mục tiêu sau khi pha loãng với bộ đệm Rexxip H. Mẫu huyết thanh người bình thường số 2, với tỷ lệ thu hồi 252,6% sử dụng PBS-T và trong vòng 25% sử dụng Rexxip H, cho thấy bộ đệm Rexxip H rất tốt trong việc loại bỏ nhiễu ma trận trong mẫu này. Hai trong số các mẫu huyết thanh bệnh này, khi không được lấy mẫu, ngay cả với bộ đệm Rexxip H, có nồng độ ngược là 32~35ng/mL. Do đó, trong thiết kế nghiên cứu trên những người mắc bệnh, các thí nghiệm bổ sung phải được lặp lại để thiết kế LLOQ ở mức 40ng/mL.

Tóm tắt:

Chuyển phương pháp phát hiện phát quang điện hóa (ECL) (LLOQ 80ng/mL) sang Gyrolab ® Trên nền tảng, việc sử dụng các cặp kháng thể và bộ đệm được tối ưu hóa đã tạo ra kết quả xét nghiệm có độ nhạy cao hơn, cải thiện LLOQ lên 30ng/mL, có thể đáp ứng các yêu cầu của nghiên cứu trong tương lai.

Gyrolab ® Mô hình dòng chảy cột ái lực của nền tảng và bộ đệm Rexxip được cấp bằng sáng chế có thể giảm thiểu sự suy giảm độ chính xác và độ nhạy của dữ liệu do hiệu ứng ma trận.

Để tìm hiểu thêm về các trường hợp khác của Gyrolab trong việc giảm hiệu ứng ma trận, vui lòng liên hệ với chúng tôi bằng cách nhấp vào đọc bản gốc.

Tài liệu tham khảo:

[1]. Selby C. Sự can thiệp trong thử nghiệm miễn dịch. Ann, Clin. Biochem. 36(Pt 6), 704–721 (1999).

[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. Bảo phủ bề mặt kháng thể thúc đẩy sự can thiệp ma trận trong các thử nghiệm miễn dịch mạch máu nhỏ vi chất. Cảm biến ACS 2021 6 (7), 2682-2690.

[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Vượt qua hiệu ứng ma trận cụ thể của bệnh trong một thử nghiệm dược động học lâm sàng sử dụng công nghệ miễn dịch vi chất lỏng. Bioanalysis, 9(16), 1207–1216 (2017).

[4]. Saloumeh K. Fischer. Công nghệ thử nghiệm liên kết liên kết: phù hợp với công cụ phù hợp với thách thức phân tích sinh học của bạn. https://www.bioanalysis-zone.com.

[5]. Shannon D. Chilewski. Giải quyết các hiệu ứng ma trận trong các thử nghiệm liên kết liên kết thông qua việc sử dụng thuốc thử và công nghệ mới. Bioanalysis (2014) 6(8), 1059–1067.