Giới thiệu
Trình tự RNA đơn bào (scRNA seq) là một kỹ thuật được sử dụng để mô tả biểu hiện gen không thiên vị trong các mẫu tế bào và mô phức tạp. Mặc dù scRNA-seq-chedi đã thay đổi sinh học hiện đại, nó vẫn còn thách thức về mặt kỹ thuật và thường tốn kém. Các giải pháp hiện có trên thị trường có thể phân tích hiệu quả một tỷ lệ nhỏ các tế bào khi có một nhóm ban đầu gồm hàng chục nghìn tế bào. Tuy nhiên, sơ đồ đơn giản để chuẩn bị thư viện scRNA-seq xử lý các nhóm tế bào hiếm vẫn còn thiếu. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một loại phát hiện tấm lỗ mới cho scRNA-seq có tỷ lệ giá tình dục cao và độ nhạy cao. Quy trình làm việc này hỗ trợ chuẩn bị thư viện mẫu hiếm từ các nhóm tế bào hiếm. Trong quy trình làm việc mới này (Hình 1), chúng tôi đã sử dụng DispenCell và đầu hút phát hiện chuyên dụng (SEED Biosciences, Thụy Sĩ), với hệ thống chuẩn bị thư viện đơn bào chuyên dụng và tối ưu hóa (MERCURIUS Bộ dụng cụ BRB-seq có độ nhạy cao, Alithea Genomics， Thụy Sĩ).
Phân phối tế bào đơn
Đầu tiên, trước khi chuẩn bị thư viện giải trình tự, chúng tôi đã kiểm tra khả năng của DispenCell trong việc phân phối các tế bào đơn trong một bộ đệm lysis chuyên dụng. Các dòng tế bào lympho tan băng từ các lọ đông lạnh, được truyền lại hai lần trước khi được thu hoạch trong hệ thống treo đơn bào. Sử dụng bộ lọc tế bào 10μm (Miltenyi Biotec, Đức) để lọc các tế bào, đếm và pha loãng trong dung dịch phân phối methyl cellulose không có RNAse (DispenMe, SEED Biosciences) đến nồng độ cuối cùng là 2 × 104 cells/mL. Sau đó, 200 tế bào được nạp từ hệ thống treo tế bào bằng cách sử dụng đầu hút cảm biến DispenCell. Thiết lập DispenCell để phân phối các tế bào đơn vào một tấm 384 lỗ được cài đặt sẵn 4,2 μL lysis buffer (HS BRB seq kit, Alithea Genomics). 96 lỗ đầu tiên được phân bổ trong khoảng 7 phút. Sau đó, dừng phân phối vì chúng tôi có đủ mẫu để phân tích xuôi dòng.
Kiểm soát chất lượng tế bào đơn
Ngay sau khi phân phối, chúng tôi sử dụng DispenSoft, một phần mềm được phát triển bởi SEED Biosciences, để xử lý hậu kỳ kiểm soát chất lượng tế bào đơn. Mỗi lỗ của tấm lỗ được biểu thị bằng một ma trận được mã hóa màu (Hình 2.a). Khi lỗ chứa một tế bào duy nhất, phần mềm sẽ đánh dấu nó là màu xanh lá cây, trong khi lỗ màu đỏ chứa không hoặc nhiều tế bào cần được loại bỏ. Để phân biệt các mảnh vỡ và tế bào, một ngưỡng được đặt bằng cách đóng cửa biểu đồ tần xuất dựa trên kích thước (Hình 2.b). Chỉ những đỉnh trên ngưỡng mới được tính là tế bào.
Ở đây chúng ta có 77 lỗ đơn bào (80% tỷ lệ phân lập đơn bào). Với DispenSoft, dữ liệu trở kháng thô cũng có thể được sử dụng để ghi lại quá trình. Mỗi đường cong trở kháng có thể được kiểm tra thủ công. Các gai đơn là đặc trưng của các tế bào đơn (Hình 2.c) trong khi nhiều tế bào tạo ra nhiều đỉnh. Điều này cho thấy DispenCell có khả năng phân phối các tế bào đơn lẻ trong bộ đệm lysis trong một quá trình đơn giản, nhanh chóng và có thể truy xuất nguồn gốc.