Giới thiệu
In sinh học 3D được định nghĩa là các cấu trúc 3D chức năng hoặc mô nhân tạo của các vật liệu tương thích tế bào và sinh học. Công nghệ này đã thay đổi lĩnh vực kỹ thuật tổ chức, cho phép tạo ra các cấu trúc của các thiết kế phức tạp được xác định trước trong khi vẫn đảm bảo khả năng lặp lại. Một số phương pháp dựa trên in sinh học 3D đã được báo cáo để kỹ thuật hóa các mô khác nhau như sụn, 2 xương, 3 cũng như trẻ hóa da. Kỹ thuật này cũng đã được sử dụng để tạo ra các mô hình khối u tiền lâm sàng mới. Trên thực tế, như một mô hình nuôi cấy tế bào 2D đang ngày càng bị nghi ngờ do thiếu tính dự đoán, in sinh học 3D đã trở thành một phương pháp thay thế để tránh vấn đề này bằng cách xử lý các phân tử có nguồn gốc từ ma trận ngoại bào và tế bào khác nhau, mô hình/hiển thị vi môi trường khối u (TME). Nhiều mô hình khối u dựa trên in sinh học 3D bao gồm ung thư phổi, ung thư vú 5 và u nguyên bào đệm 6. 7 Các mô hình này cho thấy lợi thế về thiết kế, linh hoạt và có thể lặp lại so với các chiến lược khác như bóng tế bào và organoid. Ung thư buồng trứng là một vấn đề sức khỏe cộng đồng lớn và in sinh học 3D vẫn đang được nghiên cứu như một mô hình ung thư buồng trứng. Trong loại khối u này, nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (CAF) được cho là tương tác chặt chẽ với các tế bào ung thư, đóng vai trò chính trong sự xâm lấn và kháng ung thư. Do đó CAF là chìa khóa để thiết kế các mô hình ung thư buồng trứng.
Lợi thế
Sàng lọc nội hàm cao và truyền nhiễm tức thời giúp mô tả và xác minh các thí nghiệm in sinh học 3D • Biểu hiện gen tức thời là một công cụ mạnh mẽ để tăng tính linh hoạt của các mô hình in sinh học 3D • Các công cụ phân tích đa bước sóng là cần thiết để tận dụng tối đa sức mạnh của mô hình in sinh học 3D để nghiên cứu sự tương tác của các nhóm tế bào khác nhau trong mô hình, in sinh học 3D được sử dụng để tạo ra các mô hình ung thư buồng trứng có chứa các tế bào ung thư (tế bào SKOV3) và nguyên bào sợi CAF (tế bào MeWo). Sử dụng jetOPTIMUS (Polyplus) GFP plasmid để truyền các tế bào SKOV3 và các tế bào MeWo với CellTracker và Orange CMRA Dye (ThermoFisher). Cả hai loại tế bào được chứa trong gelatin-alginate-dựa trên hydrogel để có được để tạo thành các cấu trúc giống như khối u hình trụ. Tính đồng nhất của mô hình và khả năng lặp lại phân bố tế bào trong các khối u này, hệ thống hình ảnh được đánh giá bằng ImageXpress Pico.
Kết quả và thảo luận
Như thể hiện trong Hình 1, hình ảnh cấu trúc in sinh học cho thấy sự phân bố đồng nhất của các tế bào SKOV3 thể hiện GFP và các tế bào MeWo nhuộm huỳnh quang trên ma trận gelatin-alginate (Hình 1A và B). Điều này rất quan trọng vì sự phân bố đồng nhất của các tế bào trong mực sinh học là một yếu tố quan trọng cần xem xét trong quá trình in 3D Ngoài ra, TME tự nhiên là loại tế bào được biết là chứa nhiều tương tác chặt chẽ. Do đó, điều quan trọng là tái tạo điều này trong khi xây dựng các mô hình khối u in vitro để thúc đẩy sự tương tác giữa ung thư và tế bào ma trận.
Nhiều loại tế bào nên được kết hợp trong khối u để mô phỏng tốt hơn tính không đồng nhất TME, số lượng và tỷ lệ của mỗi loại tế bào cần được kiểm soát để đảm bảo tính lặp lại. ImageXpress Pico là một ứng dụng đặc biệt phù hợp để thực hiện các điều khiển như vậy vì nó có thể chụp nhiều hình ảnh kính hiển vi một cách nhanh chóng và dễ dàng. Phần mềm CellReporterXpress cho phép định lượng nhiều tế bào, ngay cả đối với các mẫu dày, có thể được thực hiện bằng cách sử dụng phép chiếu tối đa của Z-stack. Trong hướng dẫn ứng dụng này, hệ thống này được sử dụng để phân tích mô hình khối u in sinh học của chúng tôi cho thấy khả năng lặp lại tốt về số lượng và tỷ lệ tế bào trong 6 cấu trúc in sinh học với số lượng tế bào SKOV3 trung bình (FITC) 837 ± 200 (độ lệch chuẩn ≤25%). Đối với tế bào MeWo (số lượng tế bào TRITC), số lượng trung bình là 3264,50 ± 462 (StD ≤ 15%).

Hình 1 phân tích thuốc nhuộm CMRA cấu trúc in 3D của các tế bào SKOV3 có chứa plasmid GFP chuyển và các tế bào MeWO được nhuộm CellTracker Orange. A) Hình ảnh FITC và TRITC của cấu trúc in sinh học 3D trong lỗ B3 được thu thập bằng hệ thống ImageXpress Pico (4X, Z-stack). B) Phân tích mặt nạ FITC và TRITC Cell Count được tạo bằng phần mềm CellReporterXpress. C) Số lượng tế bào trung bình trong các kênh FITC và TRITC của mẫu (5 lỗ, nhuộm và chuyển) và kiểm soát âm tính (3 lỗ, không nhuộm và không chuyển). D) Đánh giá hiệu quả truyền nhiễm, sử dụng plasmid GFP và bộ dụng cụ jetOPTIMUS-Polyplus-Transfection-Transfection (FITC-Positive Cell Percent/TRITC-Positive Cell).

Vật liệu và phương pháp
Chuẩn bị hydrogel
Để chuẩn bị hydrogel, bột gelatin và alginate được cân với chất lượng mong muốn trong 1 giờ dưới tia cực tím, sau đó hòa tan trong môi trường cần thiết thấp (MEM) được trộn trong Dulbecco Modified EagleMedium, bổ sung 10% huyết thanh bò thai. Dung dịch thu được sau đó được giữ qua đêm ở 37 ° C dưới sự khuấy từ tính, đồng nhất hóa hoàn toàn. Chuyển đổi tế bào và nhuộm Các tế bào SKOV3 được chuyển đổi bằng cách sử dụng jetOPTIMUS (Polyplus) GFP plasmid theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 10 Nói tóm lại, một lượng thích hợp DNA được pha loãng vào bộ đệm jetOPTIMUS và bổ sung thích hợp thuốc thử chuyển jetOPTIMUS. Dung dịch truyền được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó được thêm vào các tế bào SKOV3 nuôi cấy, được nuôi cấy trong bình T75 ở mức dung hợp 60-80%. Các tế bào MeWO được nhuộm bằng thuốc nhuộm CellTracker Orange CMRA (ThermoFisher), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 11 Nói tóm lại, thuốc nhuộm được hòa tan trong DMSO để chuẩn bị dung dịch làm việc và sau đó pha loãng trong môi trường MEM. Ủ tế bào ở 37 độ C trong 30 phút. Sau đó, dung dịch thuốc thử được lấy ra và thay thế bằng dung dịch tươi.hoàn thànhMôi trường nuôi cấy.

Hình 2 Sơ đồ phương pháp được sử dụng để in sinh học và hình ảnh các cấu trúc mô hình ung thư buồng trứng.