I. Chuyển mẫu: tránh ô nhiễm và mất mát

Khi chuyển mẫu từ bộ lấy mẫu sang thùng chứa xử lý (ví dụ: đĩa petri, ống ly tâm), cần phải đồng thời bảo vệ chống ô nhiễm bên ngoài và tổn thất vi sinh vật mục tiêu:

Hoạt động môi trường vô trùng:

Việc chuyển giao cần được thực hiện trong tủ an toàn sinh học, trước khi hoạt động với 75% cồn khử trùng sampler đầu, bề mặt container và tay của người vận hành; Sử dụng ống hút vô trùng, súng pipet (đầu súng cần được khử trùng) và tránh tiếp xúc với các khu vực không vô trùng (chẳng hạn như tường ngoài của thùng chứa).

Lưu ý: Nếu hoạt động trong môi trường mở, vi khuẩn trong không khí có thể trộn lẫn vào mẫu, dẫn đến số lượng khuẩn lạc cao, đặc biệt là ảnh hưởng đáng kể đến mẫu nồng độ thấp.

Rửa sạch đầy đủ chất lỏng lấy mẫu:

Đối với bộ lấy mẫu loại va chạm, sàng lọc, đầu lấy mẫu cần được rửa sạch nhiều lần (ít nhất 3 lần) bằng dung dịch rửa vô trùng (ví dụ: nước muối vô trùng 0,85%, dung dịch đệm phosphate PBS) sau khi lấy mẫu, đảm bảo rằng các vi sinh vật gắn liền hoàn toàn đi vào dung dịch rửa; Xoáy dao động 1~2 phút (tốc độ quay 2000~3000rpm), phá vỡ các cụm vi sinh vật tích tụ và cải thiện độ phân tán.

II. Pha loãng mẫu: đảm bảo độ chính xác của bội số pha loãng

Khi nồng độ vi sinh vật trong mẫu cao, cần pha loãng gradient để có được số lượng khuẩn lạc có thể đếm được (30~300CFU/đĩa), lỗi của quá trình pha loãng ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của kết quả:

Dung dịch pha loãng và thùng chứa: sử dụng ống pha loãng gradient khử trùng (ví dụ như ống xoắn ốc có dung tích 10mL), dung dịch pha loãng vô trùng 9mL được lắp sẵn (lỗi cần ≤ ± 0,1mL); Đánh dấu rõ ràng pha loãng bội số (10 ⁻ U, 10 ⁻ ², v.v.) để tránh nhầm lẫn.

Thông số kỹ thuật hoạt động:

Đảm bảo đầu ống hút/đầu súng tiếp xúc với 1~2cm dưới bề mặt chất lỏng khi pipet, tránh hít bong bóng;

Khi pha loãng từ nồng độ cao đến nồng độ thấp, mỗi bước cần được trộn đều (chà xát ống bằng tay 10~15 lần), đảm bảo pha loãng đều;

Cùng một bội số pha loãng làm 2 - 3 mẫu song song, giảm sai số ngẫu nhiên.

B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)

Sự phát triển của vi sinh vật bị ảnh hưởng rất nhiều bởi điều kiện nuôi cấy, đòi hỏi sự thống nhất nghiêm ngặt của các thông số:

Lựa chọn cơ sở bồi dưỡng và chuẩn bị:

Chọn môi trường theo loại vi sinh vật mục tiêu (ví dụ: phát hiện thạch dinh dưỡng cho vi khuẩn, thạch khoai tây glucose PDA cho nấm), môi trường cần được khử trùng triệt để (khử trùng bằng hơi nước 121 ° C trong 20 phút) và độ pH phù hợp với yêu cầu (vi khuẩn pH7.2~7.4, nấm pH5.6~5.8), tránh vi sinh vật không thể phát triển do thiếu hụt dinh dưỡng hoặc khó chịu axit và kiềm.

Kiểm soát điều kiện nuôi dưỡng:

Nhiệt độ: vi khuẩn 36 ± 1 ℃, nấm 28 ± 1 ℃, tủ nuôi cấy nhiệt độ không đổi cần hiệu chỉnh nhiệt độ hàng ngày (lỗi ≤ ± 0,5 ℃);

Thời gian: 48 ± 2 giờ nuôi cấy vi khuẩn, 72 ± 2 giờ nuôi cấy nấm, tránh nuôi cấy quá ngắn dẫn đến rò rỉ thuộc địa hoặc quá dài dẫn đến chồng chéo các thuộc địa.

Quy tắc đếm:

Chọn số lượng đĩa có số lượng thuộc địa từ 30~300CFU (dưới 30 thì lỗi kết quả lớn, trên 300 thì dễ chồng chéo);

Nếu sự khác biệt về số lượng các thuộc địa phẳng song song có cùng độ pha loãng vượt quá 1 lần (ví dụ: 20 và 50 thuộc địa phẳng có độ pha loãng 10⁻³), cần phải kiểm tra lại;

Khi đếm cần phân biệt giữa vi khuẩn mục tiêu và vi khuẩn gây ô nhiễm (có thể thông qua hình thái khuẩn lạc, kiểm tra kính nhuộm phụ trợ phán đoán).

IV. Kiểm soát chất lượng: Kiểm tra độ tin cậy toàn bộ quá trình

Thí nghiệm kiểm soát trống:

Khi mỗi lô xử lý mẫu, thiết lập khoảng trống lấy mẫu (bộ lấy mẫu không thu thập không khí, chỉ rửa đầu lấy mẫu bằng dung dịch tẩy rửa sau khi nuôi cấy) và khoảng trống hoạt động (trực tiếp cấy dung dịch tẩy rửa vô trùng), nếu số lượng khuẩn lạc trống>5CFU, chỉ ra sự hiện diện của ô nhiễm, cần phải thử nghiệm lại.

Kiểm soát tích cực và xác minh tỷ lệ thu hồi:

Định kỳ lấy mẫu được mô phỏng với nồng độ chất lỏng vi khuẩn tiêu chuẩn đã biết (ví dụ E. coli, Staphylococcus aureus) để tính toán tỷ lệ thu hồi (tỷ lệ thu hồi cần từ 70% đến 130%, nếu không sẽ cần kiểm tra hiệu quả của mẫu hoặc quy trình xử lý).

Hiệu chuẩn dụng cụ:

Bộ lấy mẫu cần định kỳ hiệu chỉnh lưu lượng (lỗi ≤ ± 5%), tránh độ lệch khối lượng lấy mẫu do lưu lượng không được phép;

Súng pipet, hộp nuôi cấy và các thiết bị khác cần được chứng nhận đo lường hàng năm để đảm bảo các thông số chính xác.