Polypeptide là một phân tử sinh học được tạo thành từ nhiều axit amin được liên kết bởi liên kết amide (liên kết peptide), là đơn vị cấu thành cơ bản của protein và là cấu trúc cốt lõi của nhiều loại thuốc, hormone, tác nhân kháng khuẩn và phân tử tín hiệu. Với sự phát triển của y sinh học, vật liệu mới và sinh học hóa học, polypeptide tổng hợp nhân tạo đã trở thành một công nghệ quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học và công nghiệp. Bài viết này sẽ giới thiệu một cách có hệ thống các nguyên tắc cơ bản của tổng hợp polypeptide, các phương pháp chính, các bước chính và ứng dụng của chúng.

I. Tổng hợp polypeptide là gì?

Tổng hợp polypeptide đề cập đến quá trình liên kết các axit amin từng cái một bằng phương pháp hóa học để tạo thành một chuỗi polypeptide có chiều dài và cấu trúc cụ thể, theo trình tự axit amin đặt trước, trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc công nghiệp. Theo hệ thống phản ứng khác nhau, nó có thể được chia thành tổng hợp pha lỏng và tổng hợp pha rắn. Trong đó, tổng hợp polypeptide pha rắn (SPPS) được nhà hóa học người Mỹ R. Bruce Merrifield nghiên cứu vào năm 1963, nhờ đó đã đoạt giải Nobel Hóa học năm 1984, hiện nay đã trở thành công nghệ chủ đạo.

II. Nguyên tắc cơ bản của tổng hợp polypeptide pha rắn

Ý tưởng cốt lõi của SPPS là: kết nối cộng hóa trị đầu C (đầu carboxyl) của chuỗi polypeptide với nhựa polymer không hòa tan, sau đó bắt đầu với đầu N (đầu amino) bằng cách thêm axit amin từng cái một và hoàn thành chu trình "khử bảo vệ-kết nối-rửa" cho mỗi axit amin được thêm vào. Toàn bộ quá trình được thực hiện trên một tàu sân bay pha rắn, và các tác nhân và sản phẩm phụ không phản ứng có thể được loại bỏ bằng cách lọc và rửa đơn giản, đơn giản hóa rất nhiều bước tinh chế.

III. Các bước chính trong tổng hợp polypeptide

1. Lựa chọn nhựa cố định với axit amin đầu tiên

Tổng hợp bắt đầu bằng việc lựa chọn các tàu sân bay pha rắn phù hợp (ví dụ: nhựa polystyrene liên kết chéo, nhựa PEG-PS, v.v.) với các nhóm chức phản ứng trên bề mặt (ví dụ: hydroxyl của nhựa Wang, amino của nhựa Rink Amide). Nhóm carboxyl của axit amin đầu tiên được kết nối với nhựa thông qua liên kết este hoặc liên kết amide và nhóm alpha-amino của nó cần được bảo vệ trước.

2. Bảo vệ và khử bảo vệ axit amin

Để ngăn chặn phản ứng phụ, các axit amin tham gia vào phản ứng phải được bảo vệ có chọn lọc:

α-amino: thường được bảo vệ bởi Fmoc (9-芴methoxycarbonyl) hoặc Boc (Schotin oxycarbonyl);

Nhóm hoạt động chuỗi bên (ví dụ: nhóm amin ε của Lys, nhóm mercapyl của Cys, nhóm carboxyl của Asp/Glu, v.v.): sử dụng nhóm bảo vệ nhạy cảm với axit (ví dụ: tBu, Trt, v.v.);

Carboxyl: Thường không được bảo vệ trong tổng hợp pha rắn vì nó đã được sử dụng để ghép nối.

Trước mỗi vòng ghép nối, nhóm bảo vệ ở đầu N của chuỗi polypeptide trên nhựa hiện tại cần được loại bỏ và nhóm amin tự do được phơi bày cho phản ứng tiếp theo.

3. Phản ứng peptide (khớp nối)

Kích hoạt nhóm carboxyl của axit amin bảo vệ tiếp theo (thường được sử dụng trong các hệ thống ngưng tụ như HBTU/HOBt/DIPEA, PyBOP, DIC/Oxyma), phản ứng với nhóm amin tự do của polypeptide trên nhựa để tạo thành các liên kết peptide mới. Phản ứng cần phải hiệu quả và nhanh chóng, tránh sự khử trùng hoặc sản phẩm phụ.

4. Bảo vệ tách và tách chuỗi bên

Khi quá trình tổng hợp chuỗi mục tiêu hoàn tất, polypeptide cần phải được cắt ra khỏi nhựa bằng thuốc thử axit mạnh như TFA, đồng thời loại bỏ tất cả các nhóm bảo vệ chuỗi bên. Chiến lược Fmoc thường được sử dụng hỗn hợp TFA/nước/scavenger (như TIS); Chiến lược Boc đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt hơn (chẳng hạn như HF hoặc TFMSA).

5. Thanh lọc và xác định

Polypeptide thô kết quả từ quá trình cracking chứa các trình tự bị thiếu, sản phẩm phụ và tạp chất cần được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao ngược (RP-HPLC). Trọng lượng phân tử sau đó được xác nhận bằng cách sử dụng phổ khối (MS), HPLC phân tích để đánh giá độ tinh khiết và phân tích thành phần axit amin nếu cần thiết hoặc đặc tính cấu trúc nhị sắc ký tròn (CD).

Bốn, hai chiến lược tổng hợp chính: Fmoc vs Boc

dự án	FmocLuật	BocLuật
α-Nhóm bảo vệ Amino	Fmoc(loại bỏ kiềm)	Boc(Loại bỏ axit)
Thuốc thử khử bảo vệ	20%Name/ DMF	TFA
Cơ sở bảo vệ chuỗi bên	Loại nhạy cảm với axit (ví dụ:tBu）	Loại ổn định axit mạnh (ví dụ:Bzl）
Điều kiện nứt	TFAMột bước để hoàn thành	Yêu cầuHFHoặc axit mạnh, hoạt động nguy hiểm
An toàn và phổ biến	Phòng thí nghiệm Mainstream	Thấp, sử dụng chuỗi đặc biệt

Hiện tại, chiến lược Fmoc/tBu đã trở nên lý tưởng cho phần lớn tổng hợp polypeptide vì nó an toàn để vận hành, điều kiện nhẹ nhàng và khả năng tương thích mạnh mẽ.

V. Ứng dụng tổng hợp polypeptide

Phát triển thuốc: chẳng hạn như chất tương tự insulin, chất chủ vận thụ thể GLP-1 (semeglutide), peptide kháng khuẩn, v.v.

Nghiên cứu và phát triển vắc-xin: Peptide kháng nguyên tổng hợp được sử dụng trong nghiên cứu miễn dịch;

Nghiên cứu khoa học cơ bản: chuẩn bị peptide đánh dấu, chất nền enzyme, phối tử thụ thể, v.v.

Mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe: chẳng hạn như peptide tín hiệu (thúc đẩy sản xuất collagen), glutathione, v.v.

Khoa học vật liệu: vật liệu nano polypeptide tự lắp ráp, cảm biến sinh học, v.v.

Thách thức và định hướng tương lai

Mặc dù công nghệ tổng hợp polypeptide đã khá trưởng thành, nhưng nó vẫn phải đối mặt với những thách thức như tổng hợp peptide dài không hiệu quả, nguy cơ chủng tộc và khó phân hủy peptide kỵ nước. Các điểm nóng nghiên cứu hiện tại bao gồm:

Nền tảng tổng hợp tự động hóa và thông lượng cao;

Vi sóng phụ trợ tăng tốc ghép nối;

Kết nối hóa học quốc gia (National Chemical Ligation) tổng hợp các peptide hoặc protein siêu dài.

Dung môi xanh thay thế DMF;

AI hỗ trợ thiết kế trình tự và tối ưu hóa tổng hợp.

Tổng hợp polypeptide là một kỹ thuật chính xác kết hợp hóa học hữu cơ, khoa học phân tử cao và công nghệ sinh học. Từ công việc tiên phong của Merrifield đến nền tảng tổng hợp tự động ngày nay, công nghệ này không chỉ thúc đẩy sự phát triển của khoa học đời sống mà còn cho thấy tiềm năng to lớn trong lĩnh vực y tế.