Để giải quyết vấn đề này, nhóm phát triển đã thiết kế một nền tảng hình ảnh huỳnh quang đa phương thức tích hợp Hệ thống định vị huỳnh quang trường rộng (WF-Nav) với microimaging hai photon thu nhỏ và microimaging ba photon thu nhỏ. Để tận dụng tối đa lợi thế của kích thích photon đơn lẻ, hệ thống WF-Nav được trang bị chức năng trường nhìn lớn và độ phân giải tế bào đơn để nhanh chóng xác định các khu vực quan tâm được chỉ định. Khi đã xác định được vị trí trong khu vực mục tiêu, hệ thống có thể chuyển đổi liền mạch sang hình ảnh hai hoặc ba photon, tiếp tục đạt được tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn cao hoặc hình ảnh tế bào thần kinh sâu. Đầu dò m2PM hoặc m3PM sau đó được gắn vào đầu chuột, giải phóng chuột để chụp ảnh chuyển động tự do.

Hình 1. Thiết kế hệ thống hình ảnh huỳnh quang đa phương thức

Hệ thống WF-Nav bao gồm một kính hiển vi trường rộng nhiều màu và bộ điều hợp đa chức năng. Hệ thống sử dụng ba đèn LED làm nguồn sáng kích thích (405nm, 473nm, 561nm) và được trang bị ống kính tập trung phi cầu có khẩu độ số cao để chuẩn trực chùm đèn LED, mỗi con đường kích thích được trang bị bộ lọc tương ứng. Để đạt được điều hướng trường nhìn lớn và cung cấp nhiều không gian để chuyển đổi liền mạch các nhóm gương đa photon, nhóm phát triển đã thiết kế một mục tiêu khô với khoảng cách làm việc dài và độ phóng đại thấp. Mục tiêu này (3.3x) có thiết kế tele ngược: nhóm phía trước cung cấp độ tiêu cự âm cho hai ống kính duplex dán, nhóm phía sau được tạo thành từ ống kính hình cầu một mảnh. Cấu trúc này di chuyển mặt phẳng chính trở lại để điều chỉnh sự khác biệt màu sắc, đạt được khoảng cách làm việc với độ dài tiêu cự hiệu quả siêu dài trong khi duy trì khẩu độ số, cuối cùng đạt được chỉ số đột phá về khoảng cách làm việc 90mm và đạt được trường nhìn hình ảnh tối đa Φ5,64mm.

Sơ đồ 2. Thiết kế kính hiển vi huỳnh quang trường rộng

Để cho phép chuyển đổi liền mạch giữa chế độ trường rộng và chế độ hình ảnh đa photon, nhóm nghiên cứu đã thiết kế một bộ điều hợp đa chức năng. Bộ chuyển đổi này kết nối các đối tượng trường rộng và điều chỉnh độ dài tiêu cự trên nền tảng điện Z-axis. Với thiết kế đầu dò m2/3PM được tiêu chuẩn hóa, đầu dò có thể được gắn chắc chắn trên cùng một giá đỡ và đảm bảo hình ảnh lấy nét đồng đều khi chuyển đổi đa photon với chế độ trường rộng.

Hình 3. Bộ điều hợp đa chức năng với chức năng Qi Focus

Mục tiêu khoảng cách làm việc 90mm này cung cấp nhiều không gian để vận hành đầu, sợi quang hoặc lắp đặt mô-đun ống kính zoom điện có thể tháo rời. Giá đỡ phần đầu được lắp đặt trên đường trượt bóng tuyến tính nhẹ với lực cản trượt cực nhỏ (khoảng 0,1N) và khoảng cách kính thiên văn 12 mm, có thể tránh được nguy cơ va chạm giữa vật kính và mẫu vật một cách hiệu quả. Bằng cách thay thế giá đỡ đầu, hệ thống có thể tương thích với các đầu khác nhau như mini2P và m3PM. Ngoài ra, nhờ kích thước của kính hiển vi dual-photon thu nhỏ so với thiết kế có thể thu lại, hệ thống cung cấp góc nhìn lớn hơn theo hầu hết các hướng, dẫn đến phạm vi quan sát mẫu rộng hơn. Thiết kế này làm tăng đáng kể hiệu quả định vị thô của mẫu.

Hình 4. So sánh góc quan sát của các vật kính khác nhau với kính hiển vi photon kép thu nhỏ

Tiếp theo, các nhà phát triển đã đánh giá hiệu suất quang học và ứng dụng thực tế của kính hiển vi huỳnh quang trường rộng. Hình ảnh các lát não của chuột Thy1-YFPH cho phép xác định rõ ràng các tế bào thần kinh và sợi trục. Hình ảnh ion canxi sống ở bước sóng 470nm và hình thái học ở bước sóng 561nm đã thu được thành công 3.804 tế bào thần kinh được đánh dấu GCaMP6f cũng như 4.650 tế bào thần kinh hình sao biểu hiện mCherry ở chuột. Những kết quả này chứng minh khả năng đa màu, độ phân giải tế bào đơn và khả năng hình ảnh thông lượng cao của kính hiển vi trường rộng này và cung cấp hiệu suất vượt trội để điều hướng các khu vực mục tiêu quan tâm.

Video 5. Microscope trường rộng thu nhỏ hình ảnh thông lượng cao

Để làm cho công việc hình ảnh m2PM mượt mà hơn ở chuột di chuyển tự do, các nhà phát triển đã thiết lập một bộ quy trình hình ảnh tiêu chuẩn để cải thiện hiệu quả hình ảnh m2PM ở động vật di chuyển tự do. Bắt đầu bằng cách tiêm virus và phẫu thuật trên động vật, chẳng hạn như cấy cửa sổ sọ hoặc cấy GRIN Lens, sau đó chờ 2-4 tuần để đảm bảo biểu hiện đầy đủ của virus và phục hồi chấn thương phẫu thuật. Ví dụ, trong một thí nghiệm, chúng tôi gắn nhãn GCaMP6 và mCherry trong các tế bào thần kinh vỏ não vận động chính (M1), sau đó gắn chuột vào máy chạy bộ dưới thiết bị WF-Nav. Sau đó định vị khu vực quan tâm của mục tiêu thông qua kính hiển vi trường rộng và nhắm vào trung tâm trường nhìn. Sau đó chuyển sang chế độ m2PM thông qua bộ chuyển đổi, chụp ảnh photon kép hai màu ở bước sóng 920nm và 1030nm, và cuối cùng là điều chỉnh tốt trục XY và mặt phẳng tiêu cự, cho phép xác nhận khu vực mục tiêu cuối cùng trong vài phút. Trong hầu hết các trường hợp, mặt phẳng tiêu cự mục tiêu được nâng lên khoảng 25 µm để bù đắp cho sự thay đổi tiêu điểm do sự co lại của xi măng, sau đó Baseplate được gắn vào đầu của động vật và sau khoảng 10 phút chữa bệnh, chuột có thể thực hiện hình ảnh chuyển động tự do.

Hình 6. Tiêu chuẩn hóa quy trình hình ảnh vi mô hai photon hoạt động tự do

Các nhà phát triển đã xác minh hệ thống bằng cách chụp ảnh tín hiệu canxi và cấu trúc của tế bào thần kinh trong các thí nghiệm xã hội trên chuột, với toàn bộ quá trình cài đặt mất khoảng 20 phút và tỷ lệ thành công lên tới 100% (n=15), giúp cải thiện đáng kể hiệu quả thí nghiệm bằng cách dễ dàng nắm bắt ngay cả đối với các nhà nghiên cứu thiếu kinh nghiệm. Ngoài ra, hình ảnh lặp đi lặp lại nhiều ngày của các tế bào thần kinh lớp 2 và astrocytes ở vùng M1 cho thấy việc đăng ký trường nhìn ổn định mà không cần cài đặt lại Baseplate.

Hình 7. Hình ảnh trường nhìn giống nhau nhiều ngày

Nhờ thiết kế cơ học tiêu chuẩn, đầu hình ảnh M3PM có thể dễ dàng gắn vào giá đỡ. Ứng dụng bộ điều hợp đa chức năng cho phép chuyển đổi liền mạch từ chế độ trường rộng sang chế độ hình ảnh ba photon. Do những hạn chế về độ sâu hình ảnh của kính hiển vi đơn photon trường rộng, tín hiệu sâu thường khó phát hiện; Mặc dù các mạch máu bề mặt có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo nhất định, khu vực tiêm virus giữ lại lớp bề mặt cung cấp các dấu hiệu huỳnh quang trực tiếp hơn, giúp căn chỉnh các vị trí sâu hơn trên trục thẳng đứng. Các nhà phát triển đã ghi lại thành công hoạt động thần kinh vùng postsubiculum sâu tới 1020μm từ bề mặt vỏ não ở những con chuột có đầu cố định, biểu hiện GCaMP6f và tiến hành các thí nghiệm thăm dò hành vi vắng mặt ở chuột để ghi lại hoạt động tín hiệu canxi kéo dài ở độ sâu 670 μm.

Hình 8. Thu nhỏ cố định triphoton với hình ảnh hành vi tự do

Công tác này do giáo sư Ngô Nhuận Long (tác giả thông tin) Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Thông tin Bắc Kinh, giáo sư Vương Ái Dân, giáo sư Trình Hòa Bình, v. v. hoàn thành.

[Tài liệu tham khảo]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Hệ thống điều hướng huỳnh quang trường rộng cho hình ảnh đa photon thu nhỏ hiệu quả trong động vật hành vi tự do. Neurophotonics. 2025; 12(2):025018. Doi: 10.1117 / 1.NPh.12.2.025018