Kính hiển vi laser đồng tập trung Leica

Kính hiển vi đồng tập trung laser TCS SP8 DLS Leica kết hợp những lợi ích của hai hệ thống hình ảnh: Với Leica TCS SP8 DLS (Digital Light Sheet), bạn có thể đạt được đồng tập trung trên kính hiển vi bằng cách sử dụng ánh sáng một mặt phẳng nhẹ nhàng. Bằng cách phát triển gương TwinFlect, chúng tôi có thể biến nền tảng đồng tập trung Leica TCS SP8 thành một kính hiển vi đa chức năng đơn giản và dễ sử dụng.

Kính hiển vi Leica Laser Co-Focus (như Leica SP8, Stellaris Series) là một hệ thống hình ảnh 3D có độ phân giải cao được sử dụng rộng rãi trong y sinh học, khoa học vật liệu và các lĩnh vực khác. Hoạt động của nó đòi hỏi sự kết hợp của quang học, điều khiển laser và công nghệ xử lý hình ảnh, sau đây là hướng dẫn hoạt động chi tiết:

I. Chuẩn bị trước khi hoạt động

1. Kiểm tra môi trường và thiết bị

Yêu cầu môi trường:

Phòng tối độc lập hoặc môi trường che ánh sáng để tránh ánh sáng bên ngoài can thiệp vào tín hiệu huỳnh quang.

Nhiệt độ được kiểm soát ở 20-25 ℃, độ ẩm ≤60%, ngăn ngừa sương ống kính hoặc lỗi mạch.

Kiểm tra thiết bị:

Xác nhận rằng đèn trạng thái laser (ví dụ: 405nm, 488nm, 561nm, 633nm) là bình thường (màu xanh lá cây là sẵn sàng).

Kiểm tra xem mục tiêu (ví dụ: gương dầu 10x/0.3, 20x/0.75, 63x/1.4) có sạch không và chuyển động của bàn mang trơn tru không.

Bật hệ thống làm mát (chẳng hạn như máy làm lạnh nước laser) để đảm bảo nhiệt độ ổn định ở giá trị cài đặt (thường là 18-22 ℃).

2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu sinh học:

Các tế bào sống cần được nuôi cấy trong các đĩa petri chuyên dụng co-focus (như Lab-Tek II) và tránh các slide thông thường gây khó khăn cho việc tập trung.

Cắt mô cố định yêu cầu niêm phong bằng viên nén chống huỳnh quang như ProLong Gold, có độ dày ≤20 μm.

Mẫu vật liệu:

Các mẫu không trong suốt cần được đánh bóng đến độ nhám bề mặt Ra<0,1μm và các mẫu trong suốt như polyme cần tránh nhiễu huỳnh quang tự phát.

Yêu cầu đánh dấu:

Thuốc nhuộm huỳnh quang phải phù hợp với bước sóng laser (chẳng hạn như DAPI được kích thích ở 405nm và Alexa Fluor 488 được kích thích ở 488nm).

Khi đánh dấu nhiều màu, hãy đảm bảo rằng không có sự chồng chéo trong phổ phát ra thuốc nhuộm (tín hiệu có thể được tách ra bằng chức năng phân tách phổ).

II. Quy trình hoạt động cơ bản

1. Khởi động và khởi tạo

Thứ tự khởi động:

Bật nguồn điện 2. Khởi động hệ thống làm mát laser 3. Mở kính hiển vi chính → 4. Khởi động phần mềm điều khiển (như LAS X hoặc Stellaris Suite).

Phần mềm tự kiểm tra:

Phần mềm tự động phát hiện laser, đầu quét, bàn vận chuyển và các mô-đun khác, xác nhận trạng thái là "sẵn sàng".

Chạy chức năng "Daily Check" để hiệu chỉnh đường dẫn ánh sáng và độ nhạy của hệ thống phát hiện (ví dụ: tăng PMT, công suất laser).

2. Định vị và lấy nét mẫu

Xem trước kính lúp thấp:

Chọn gương không khí 10x, tắt laser và sử dụng ánh sáng truyền qua như đèn halogen để nhanh chóng xác định vị trí khu vực mẫu.

Di chuyển đến vị trí mục tiêu bằng núm XY của tàu sân bay hoặc bằng chức năng điều hướng phần mềm.

Lấy nét chung:

Bật laser 488nm (công suất thấp, chẳng hạn như 5%) và chọn chế độ "Live" để xem trong thời gian thực.

Điều chỉnh động cơ bước trục Z, sử dụng công cụ "Fine Focus" để dần dần tập trung cho đến khi tín hiệu huỳnh quang mạnh.

Khi chuyển sang mục tiêu có độ phân giải cao hơn, chẳng hạn như gương dầu 63x, cần phải nhỏ giọt dầu đặc biệt (chẳng hạn như dầu Type F) giữa mục tiêu và nắp.

3. Cài đặt tham số thu thập hình ảnh

Công suất laser với mức tăng PMT:

Công suất laser: Tăng dần từ 1% và tránh tẩy trắng ánh sáng (thường không quá 20%).

Tăng PMT: Điều chỉnh cường độ tín hiệu từ 100-800 (hình ảnh 12 bit) để tránh bão hòa (>4095).

Thông số quét:

Độ phân giải: 512 × 512 (xem trước nhanh) hoặc 2048 × 2048 (hình ảnh chính xác cao) được chọn theo yêu cầu.

Tốc độ quét: trung bình 1-4 dòng (tăng khi tiếng ồn lớn) và trung bình 1-8 khung hình (giảm khi hình ảnh động tế bào sống).

Kích thước lỗ pin: thường được đặt thành 1 đơn vị Airy (AU), độ phân giải cân bằng so với tỷ lệ tín hiệu-nhiễu.

Cài đặt phổ:

Khi đánh dấu nhiều màu, quét phổ phát xạ mẫu ở chế độ "Lambda Scan" để thiết lập phạm vi bước sóng (ví dụ: DAPI: 410-480nm, Alexa Fluor 488: 500-550nm).

4. Hình ảnh 3D và chuỗi thời gian

Xếp chồng trục Z:

Thiết lập vị trí bắt đầu/kết thúc và bước (chẳng hạn như 0,5μm), phần mềm tự động chụp ảnh nhiều lớp và tổng hợp các mô hình 3D.

Chuỗi thời gian:

Khi chụp ảnh tế bào sống, thiết lập khoảng thời gian (ví dụ: 1 khung hình mỗi 30 giây) và tổng số khung hình (ví dụ: 100 khung hình) để ghi lại quá trình động.

Kích hoạt tính năng "Autofocus" để giữ cho tiêu điểm ổn định và tránh di chuyển tế bào dẫn đến mất tập trung.

III. Ứng dụng chức năng kính hiển vi laser co-focus Leica

Chế độ chiếu sáng (Light sheet)

Thích hợp cho hình ảnh độc tính ánh sáng thấp nhanh chóng của các mẫu dày như phôi cá ngựa vằn.

Các bước hoạt động:

Chuyển sang mô-đun chiếu sáng, điều chỉnh độ dày chiếu sáng (thường là 2-5μm).

Thiết lập thu thập đồng bộ camera kép (chẳng hạn như ánh sáng truyền qua và tín hiệu huỳnh quang).

Xây dựng lại cấu trúc ba chiều bằng cách ghép các hình ảnh đa góc với chức năng "Multi View".

2. Hình ảnh siêu phân giải (như STED)

Vượt qua giới hạn nhiễu xạ, độ phân giải lên tới 20-50nm.

Điểm hoạt động:

Sử dụng các đối tượng STED chuyên dụng như gương dầu 100x/1.4 và laser depletion như 592nm.

Điều chỉnh công suất laser depletion (thường là 50-200mW) và chế độ mặt nạ pha (như 2D hoặc 3D STED).

Sau khi thu thập, xử lý cuộn ngược được thực hiện bằng phần mềm "Huygens" hoặc "Thunder".

3. Phân chia quang phổ và khử convolution tuyến tính

Tách các tín hiệu chồng chéo khi đánh dấu nhiều màu:

Lấy thư viện quang phổ phát xạ mẫu ở chế độ "Lambda Scan".

Tải dữ liệu quang phổ trong công cụ "Spectral Unmixing", phần mềm tự động tính toán tín hiệu thuần túy của từng kênh.

Điều chỉnh ngưỡng để loại bỏ nhiễu nền và lưu hình ảnh sau khi chia.

IV. Bảo trì và bảo trì

1. Vệ sinh hàng ngày

Thành phần quang học:

Loại bỏ vật kính, bụi bề mặt bộ lọc bằng bong bóng thổi, vô hiệu hóa tăm bông hoặc khăn giấy lau trực tiếp.

Để làm sạch, nhúng một lượng nhỏ ethanol (hoặc dung dịch làm sạch đặc biệt) bằng giấy ống kính và chà nhẹ theo hình xoắn ốc.

Bàn vận chuyển và kho mẫu:

Lau bằng vải chống tĩnh điện để tránh ngâm dầu còn lại hoặc niêm phong viên nén.

2. Bảo trì laser

Giới hạn sử dụng:

Làm việc liên tục không quá 8 giờ để tránh hư hỏng do quá nóng của ống laser.

Giảm công suất laser xuống 1% khi tắt máy trước khi tắt công tắc laser.

Giám sát cuộc sống:

Xem tuổi thọ còn lại trong giao diện "Laser Status" của phần mềm (ví dụ: laser 488nm thường ≥20.000 giờ).

Liên hệ với Leica trước để thay ống laser khi gần hết tuổi thọ.

3. Hiệu chuẩn thường xuyên

Hiệu chuẩn đường quang:

Căn chỉnh trục quang và lỗ kim được hiệu chỉnh hàng quý bằng cách sử dụng microsphere huỳnh quang tiêu chuẩn như TetraSpeck.

Hiệu chuẩn cơ học:

Kiểm tra độ chính xác trục XY/Z của tàu sân bay hàng năm (lỗi nên<0,1μm), điều chỉnh các thông số động cơ bước nếu cần thiết.

V. Giải quyết các vấn đề thường gặp

Hình ảnh không có tín hiệu

Kiểm tra xem tia laser có bật hay không, mức tăng PMT>0 và bộ lọc có khớp không (chẳng hạn như tín hiệu bộ lọc phát ra không bị chặn).

Làm mờ ảnh

Xác nhận xem mục tiêu có đủ dầu hay không, liệu lỗ kim có bị lệch hay không, và liệu mẫu có bằng phẳng hay không (chẳng hạn như sự nổi lên của tế bào sống dẫn đến mất tập trung).

Công suất laser không ổn định

Làm sạch cửa sổ thoát laser và kiểm tra xem nhiệt độ nước của hệ thống làm mát có nằm trong phạm vi cài đặt (ví dụ: ± 0,5 ℃).

Phần mềm Caton

Tắt các chương trình lớn khác, giảm độ phân giải hình ảnh hoặc tốc độ quét, hoặc tăng bộ nhớ máy tính (khuyến nghị ≥ 32GB).

VI. Các biện pháp phòng ngừa an toàn của kính hiển vi laser đồng tập trung Leica

An toàn laser:

Đeo kính bảo vệ bằng laser khi vận hành (bước sóng cần bao phủ tất cả các dây laser đang sử dụng).

Không nhìn thẳng vào chùm tia laser hoặc phản xạ ánh sáng, tránh tiếp xúc lâu dài với tia laser công suất cao (ví dụ>50mW).

An toàn sinh học:

Khi xử lý các tế bào sống hoặc mầm bệnh, hoạt động bên trong tủ an toàn sinh học để ngăn ngừa ô nhiễm mẫu.

An toàn hóa chất:

Khi làm sạch bằng dung môi hữu cơ, chẳng hạn như ethanol, hãy vận hành trong tủ hút để tránh hít phải khí dễ bay hơi.