Khai thác một bước và ly tâm hai bước: tiền xử lý mẫu mô

Khi xác định hoạt động của ciscuptase, việc xử lý mẫu phải được thực hiện trong môi trường thiếu oxy. Lấy gan động vật tươi hoặc tế bào nuôi cấy và thêm một bộ đệm làm phẳng trước khi làm lạnh (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM disulfosucrose), bộ đệm cần được truyền trước 15 phút với nitơ có độ tinh khiết cao để loại bỏ oxy hòa tan. Sử dụng máy san lấp mặt bằng thủy tinh để san lấp mặt bằng tay 10-12 lần trên băng, tránh tạo bọt khí. Bùn đồng đều được chuyển đến ống ly tâm kín, 10.000 × g ly tâm ở 4 ℃ trong 20 phút. Thượng Thanh tức là thành phần tách ti thể có chứa enzym Thuận Ô Đầu. Nếu bạn cần độ tinh khiết cao hơn, bạn có thể tách ty thể bằng ly tâm vi sai trước khi phá vỡ màng ty thể bằng dung dịch đệm chứa 0,1% Triton X-100.

Xây dựng hệ thống phản ứng: tỷ lệ chính xác của chất nền và đồng yếu tố

Thử nghiệm hoạt động sử dụng phương pháp isocitrate dehydrogenase kết hợp. Chất lỏng phản ứng có tổng thể tích 1 mL với các thành phần như sau: 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM NADP⁺, 0,5 U/mL Isocitrate dehydrogenase (từ tim lợn), 1 mM Trisodium Citrate làm chất nền và chiết xuất mẫu 50-100 μL. Lưu ý rằng trisodium citrate cần phải được điều chế tươi để tránh đặt lâu dài để tạo thành lượng mưa. Các chất nền bị bỏ qua trong chăm sóc hoặc các mẫu bị vô hiệu hóa bằng nhiệt. Isocitrate dehydrogenase đòi hỏi phải kiểm tra trước hoạt động sản xuất NADPH sau khi bổ sung isocitrate ở 340 nm. Toàn bộ hệ thống phản ứng ở nhiệt độ trước 30 độ C trong 5 phút.

Công thức theo dõi và tính toán động

Thay đổi độ hấp thụ được theo dõi liên tục ở 340 nm ngay sau khi thêm mẫu, được ghi lại mỗi 30 giây trong 5 phút. Citrulactase chuyển đổi axit citric thành axit isocitric, được xúc tác bởi các enzyme kết hợp để tạo ra NADPH, với tốc độ tăng độ hấp thụ 340 nm phản ánh hoạt động của Citrulactase. Lượng enzyme cần thiết để tạo ra 1 nmol NADPH mỗi phút là 1 đơn vị hoạt động. Để tính toán, cần sử dụng hệ số khử mol 6,22 × 10³M ⁻⁻·cm⁻⁻⁻. Lưu ý rằng mẫu có thể chứa NADPH nội sinh trong chiết xuất ty thể nền của chính nó, cần đọc độ dốc ban đầu trước khi thêm axit citric.

Thuốc thử chính để bảo vệ cụm sắt-lưu huỳnh

Nồng độ disulfitol cần được kiểm soát chính xác ở mức 1-2 mM. Dưới 0,5 mM không thể khử hiệu quả các ion sắt bị oxy hóa và trên 5 mM sẽ liên kết cạnh tranh với các nguyên tử sắt trong cụm sắt-lưu huỳnh. Khả năng giảm được xác minh bằng phương pháp ferro-cyanide-potassium-method trước mỗi đợt phát hiện: lấy 100 μL 1 mM DTT và thêm 200 μL 0,1 mM ferro-cyanide-potassium-solution, độ hấp thụ ở 420 nm nên giảm từ 0,9 xuống dưới 0,1 trong vòng 3 giây. Ngoài ra, 10% glycerin có thể được thêm vào bộ đệm như một chất ổn định protein để giảm tổn thất hoạt động do đông lạnh.