Thiết bị lai phân tử là thiết bị cốt lõi được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử để phát hiện axit nucleic (DNA/RNA) hoặc protein. Nó được sử dụng rộng rãi trong phân tích biểu hiện gen, phát hiện đột biến và các lĩnh vực khác. Hoạt động của nó đòi hỏi phải tuân thủ nghiêm ngặt quy trình tiêu chuẩn hóa để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm. Sau đây là quy trình sử dụng hoàn chỉnh và các điểm then chốt:

Chuẩn bị trước khi thí nghiệm

1. Chuẩn bị mẫu với đầu dò

- Chiết xuất axit nucleic mục tiêu (ví dụ: DNA bộ gen, mRNA) theo mục đích thí nghiệm và chuyển sang hỗ trợ pha rắn (màng nylon/màng PVDF) sau khi cắt enzyme, tách điện di.

- Đầu dò đánh dấu: Đầu dò oligonucleotide cụ thể được đánh dấu bằng đồng vị (³P), thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc biotin, cần xác minh độ tinh khiết và nồng độ của đầu dò.

2. Kiểm tra dụng cụ

- Xác nhận rằng hệ thống kiểm soát nhiệt độ của máy lai là bình thường, chức năng của máy lắc ổn định và cuộn phim kín không bị hỏng do lão hóa.

- Làm nóng trước thiết bị đến nhiệt độ thiết lập (thường là 42-65 ° C, tùy thuộc vào loại đầu dò), giảm tác động của biến động nhiệt độ đối với hiệu quả lai.

3. Cấu hình thuốc thử

- Công thức dung dịch tiền lai (chứa DNA tinh chất cá hồi, SDS và các chất bịt kín khác), dung dịch lai và dung dịch rửa nồng độ muối gradient, chú ý lọc khử trùng để tránh ô nhiễm.

II. Các bước hoạt động cốt lõi

1. Trước khi lai

- Đặt màng cố định axit nucleic cần kiểm tra vào ống lai, thêm đủ lượng màng ngâm chất lỏng tiền lai, ủ trong 1-2 giờ ở nhiệt độ thiết lập. Bước này được thiết kế để đóng các vị trí liên kết không đặc hiệu trên màng và giảm tiếng ồn nền.

- * Kiểm soát chính *: Giữ dao động nhẹ để thúc đẩy lưu thông chất lỏng và tránh tạo bong bóng.

2. Phản ứng lai

- Bỏ chất lỏng lai trước, trực tiếp thêm chất lỏng lai có chứa đầu dò đánh dấu (nồng độ cuối cùng của đầu dò thường là 1-10 ng/mL), tiếp tục ủ qua đêm (8-16 giờ).

- * Chiến lược tối ưu hóa *: Nhiệt độ lai=giá trị Tm -5 ℃ (Tm là nhiệt độ giải chuỗi đầu dò), tính đặc hiệu và độ nhạy.

3. Phân loại phim rửa

- Sử dụng dung dịch giặt giảm nồng độ muối theo trình tự (ví dụ: sử dụng lần lượt 2 × SSC → 0,5 × SSC → 0,1 × SSC) để làm sạch từng phần, loại bỏ dần các đầu dò không kết hợp hoặc không phù hợp.

- * Kỹ thuật vận hành *: Hút hết chất lỏng còn lại trước mỗi lần thay đổi chất lỏng, rửa chặt chẽ cao có thể cải thiện tính đặc hiệu, nhưng rửa quá mức có thể dẫn đến mất tín hiệu thực.

III. Phát hiện tín hiệu và phân tích dữ liệu

1. Thu thập hình ảnh

- Chọn phương pháp phát hiện tương ứng theo loại đánh dấu đầu dò: X-quang áp suất cần thiết để tự phát triển phóng xạ; Phương pháp phát quang hóa học sử dụng máy ảnh CCD; Đầu dò huỳnh quang có thể quét trực tiếp.

- * Kiểm soát phơi sáng *: Điều chỉnh thời gian phơi sáng để tránh bão hòa, đồng bộ hóa cài đặt kiểm soát trống để loại trừ nhiễu cơ bản.

2 Kết quả

- Phân tích định lượng sử dụng phần mềm ImageJ để tính toán giá trị thang màu xám của dải, đánh giá bán định lượng mức độ biểu hiện gen; Phân tích định tính tập trung vào sự phù hợp của vị trí dải với trọng lượng phân tử dự kiến.

* Xử lý bất thường *: Trong trường hợp dải không đặc hiệu, cần phải tối ưu hóa lại thiết kế đầu dò hoặc cải thiện độ cứng giặt.

IV. Xử lý và bảo trì hậu quả

1. Xử lý chất thải

- Chất thải có chứa đồng vị được xử lý theo thông số kỹ thuật chất thải phóng xạ và chất phản quang huỳnh quang/hóa học được thu hồi vào thùng chứa đặc biệt.

2. Chăm sóc dụng cụ

- Xả chất lỏng trong ống lai, ngâm khử trùng 70% ethanol sau khi rửa sạch bằng nước sạch, định kỳ hiệu chỉnh cảm biến nhiệt độ.

- Ghi lại các thông số thí nghiệm này (nhiệt độ, tốc độ quay, thời gian) vào nhật ký thiết bị để tham khảo thí nghiệm tiếp theo.

Hoạt động của máy lai phân tử cần kiểm soát chính xác nhiệt độ, thời gian và môi trường giải pháp, bất kỳ độ lệch liên kết nào cũng có thể dẫn đến kết quả dương tính giả/âm tính giả. Các thí nghiệm song song có kiểm soát được khuyến khích cho người dùng lần đầu tiên và các điều kiện lai tốt nhất được xác định thông qua các thí nghiệm trước. Thao tác quy phạm hóa phối hợp với biện pháp kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt, mới có thể đảm bảo tính tin cậy của kết quả thí nghiệm.