Tóm tắt

Công nghệ chuyển đổi điện tử sống võng mạc ở chuột sơ sinh cung cấp một phương tiện quan trọng để nghiên cứu phát triển võng mạc và bệnh tật. Nghiên cứu sử dụng máy đục lỗ sóng vuông Venid Gene Pulse 830 để tối ưu hóa các thông số chuyển đổi điện để đạt được sự phân phối và biểu hiện hiệu quả cao của gen ngoại sinh trên võng mạc của chuột sơ sinh, cải thiện đáng kể hiệu quả chuyển đổi và cung cấp một nền tảng công nghệ đáng tin cậy cho nghiên cứu cơ bản liên quan đến võng mạc và y học chuyển đổi.

Giới thiệu

Võng mạc là một tổ chức quan trọng trong việc truyền tín hiệu thị giác, nghiên cứu về cơ chế phát triển và cơ chế phát sinh bệnh tật luôn là điểm nóng trong lĩnh vực mắt. Võng mạc của chuột sơ sinh đang trong giai đoạn phát triển nhanh, khi hoạt động di truyền có thể nghiên cứu hiệu quả vai trò của gen trong sự khác biệt, di chuyển và thiết lập chức năng của tế bào võng mạc. Tuy nhiên, phương pháp phân phối gen truyền thống có hiệu quả thấp trong hoạt động võng mạc sống, tổn thương tế bào lớn, khó đáp ứng nhu cầu nghiên cứu khoa học chính xác.

Công nghệ chuyển đổi điện làm thay đổi tính thấm của màng tế bào ngay lập tức thông qua điện trường xung, cho phép các đại phân tử như axit nucleic ngoại sinh xâm nhập vào tế bào, cho thấy lợi thế trong việc phân phối gen của mô sống. Với công nghệ xung sóng vuông tiên tiến, hệ thống giám sát thông minh và thiết lập thông số linh hoạt, máy đục lỗ kiểu sóng vuông Venid Gene Pulse 830 cung cấp giải pháp hiệu quả và chính xác cho việc chuyển đổi điện sống võng mạc ở chuột sơ sinh, giúp các nhà khoa học vượt qua nút thắt công nghệ truyền thống.

Vật liệu&phương pháp

1. Động vật thí nghiệm

Chuột sơ sinh C57BL/6J 0-2 ngày sau khi sinh (P0-P2), được cung cấp bởi phòng thí nghiệm động vật SPF này, được nuôi ở nhiệt độ môi trường (22 ± 2) ℃, độ ẩm 50% -60%, chu kỳ ánh sáng/bóng tối 12 giờ.

2. Thuốc thử chính

DNA plasmid (chứa gen GFP mục đích, được xây dựng trong phòng thí nghiệm này), một tác nhân nhất định (để xây dựng bộ đệm điện, chứa NaCl, KCl, glucose và các thành phần khác, pH được điều chỉnh đến 7,4), thuốc gây mê (isoflurane, được sử dụng trong gây mê chuột), thuốc thử khử trùng (ethanol 75%).

3. Dụng cụ chính

Máy đục lỗ sóng vuông Venid Gene Pulse 830, kính hiển vi thị giác (một nhãn hiệu, được sử dụng để quan sát hoạt động phẫu thuật), kim tiêm vi mô (đường kính ngoài 10-15μm, được sử dụng để tiêm plasmid), tấm sưởi ấm nhiệt độ không đổi (duy trì nhiệt độ cơ thể của chuột).

Các bước thử nghiệm

1. Gây mê và sửa chữa chuột

Những con chuột sơ sinh được đặt trong một hộp gây mê có chứa isoflurane và sau khi gây mê được chuyển sang một tấm sưởi ấm nhiệt độ không đổi, giữ cho nhiệt độ cơ thể ổn định. Sử dụng băng keo nhẹ nhàng cố định đầu và tứ chi của chuột, đảm bảo tư thế chuột ổn định trong quá trình phẫu thuật.

2. Định vị võng mạc và tiêm plasmid

Dưới kính hiển vi thị giác quan, DNA plasmid của gen chứa mục đích (ở nồng độ 1-2 μg/μL) được hấp thụ bằng một lượng nhỏ kim mẫu trên, từ mép giác mạc bên thái dương của nhãn cầu chuột, từ từ đưa đầu kim vào khoang cơ thể thủy tinh, tránh ống kính và tiêm chính xác dung dịch plasmid 5-10 μL vào khoang dưới võng mạc. Trong quá trình tiêm chú ý kiểm soát độ sâu và tốc độ tiêm, tránh làm tổn thương mô võng mạc.

3. Cài đặt và vận hành thông số thủng điện

Máy đục lỗ loại sóng vuông Venid Gene Pulse 830 sử dụng hệ thống tối ưu hóa được lập trình sẵn, đặc điểm mô võng mạc của chuột sơ sinh, chọn chế độ chuyển đổi tế bào động vật có vú, gọi các thông số khuyến nghị của tế bào võng mạc tích hợp: xung sóng vuông, điện áp được điều chỉnh theo tuổi chuột và kích thước nhãn cầu (thường là 50-80V), thời gian xung 10-20ms, thời gian xung 3-5 lần, khoảng thời gian xung 1-2s.

Nhẹ nhàng kẹp mắt chuột bằng điện cực loại nhíp tùy chỉnh (khoảng cách giữa các điện cực 1-2mm, bề mặt được xử lý cách nhiệt để tránh rò rỉ hiện tại), đảm bảo điện cực phù hợp chặt chẽ với bề mặt mắt và không ép mắt. Bắt đầu chương trình thủng điện bằng công tắc chân, màn hình cảm ứng 10 inch của thiết bị hiển thị động thái sóng xung và thông số trong thời gian thực, giúp người thí nghiệm theo dõi toàn bộ quá trình. Trong quá trình thủng điện, thiết bị tự động thực hiện phát hiện trở kháng thông minh, đo điện trở mẫu trước xung, điều chỉnh động các thông số để đảm bảo rằng mỗi điều kiện sốc phù hợp với trạng thái tế bào võng mạc. Đồng thời, bảo vệ hồ quang và công nghệ chuyển đổi cực ngăn chặn thiệt hại hồ quang, phá vỡ hàng rào điện tích màng tế bào và nâng cao tỷ lệ thành công của các tế bào khó chuyển đổi.

4. Điều trị hậu phẫu

Sau khi thao tác xoay điện hoàn tất, di chuyển chuột trở lại bên cạnh chuột cái, giữ cho môi trường ấm áp và yên tĩnh. Theo dõi tình trạng mắt và sự sống sót của chuột mỗi ngày sau phẫu thuật để đảm bảo không có nhiễm trùng và các biến chứng khác xảy ra.

Kết quả&Thảo luận

Phát hiện hiệu quả truyền

3 ngày sau khi quay điện, nhãn cầu chuột được lấy và các lát đóng băng võng mạc được chuẩn bị để xem sự biểu hiện của protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) qua kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy, tất cả các lớp tế bào võng mạc đều có thể nhìn thấy tín hiệu huỳnh quang GFP rõ rệt, đặc biệt là lớp tế bào hạch, lớp nhân trong và lớp nhân ngoài, hiệu quả truyền nhiễm tăng hơn 40% so với phương pháp truyền thống (dựa trên dữ liệu thử nghiệm nội bộ của Venid). Điều này được hỗ trợ bởi điện trường cường độ cao của Venid Gene Pulse 830 Square Wave Type Electropetrator ngay lập tức định hình lại tính thấm của màng tế bào, cho phép phân phối hiệu quả các đại phân tử axit nucleic.

Sự sống còn của tế bào và đánh giá tổn thương mô

Cấu trúc mô võng mạc được quan sát bằng cách nhuộm sumogen-ichrome (HE), các lớp võng mạc của chuột trong nhóm chuyển điện có cấu trúc rõ ràng và các tế bào được sắp xếp gọn gàng, không có phản ứng hoại tử tế bào hoặc viêm đáng kể nào xảy ra so với nhóm đối chứng. Thí nghiệm loại trừ Taizhuan Blue cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào võng mạc sau khi chuyển điện đạt trên 90%, cho thấy công nghệ chuyển điện này gây tổn thương nhỏ cho mô võng mạc, đảm bảo tính khả thi của các thí nghiệm tiếp theo.

Lợi thế so sánh với công nghệ truyền thống

Phương pháp truyền nhiễm vector virus truyền thống tồn tại các vấn đề như chu kỳ chuẩn bị dài, chi phí cao, dung lượng vector hạn chế và có thể gây ra phản ứng miễn dịch. Công nghệ chuyển đổi điện sinh thể sống được trung gian bởi máy đục lỗ sóng vuông Gene Pulse 830, không cần đóng gói virus, có thể trực tiếp cung cấp các phân tử lớn như DNA, RNA và protein, hoạt động dễ dàng và nhanh chóng, chi phí thấp, đồng thời tránh được nguy cơ tiềm ẩn của chất mang virus. Hệ thống giám sát thông minh dạng sóng đầy đủ của nó đảm bảo rằng quá trình thí nghiệm là minh bạch và có thể kiểm soát, dữ liệu có thể được truy nguyên, giúp tái hiện chính xác kết quả nghiên cứu khoa học. Hệ thống tối ưu hóa được lập trình sẵn được xây dựng trong thư viện thông số dòng tế bào thường được sử dụng, một cuộc gọi một cú nhấp chuột, đồng thời hỗ trợ các thông số xung tùy chỉnh, phù hợp với các kịch bản phức tạp như võng mạc chuột sơ sinh, cho thấy tính linh hoạt và khả năng ứng dụng mạnh mẽ.

Tối ưu hóa kỹ thuật&Thận trọng

Trong quá trình thử nghiệm, người ta thấy rằng tối ưu hóa các thông số thủng điện là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả truyền nhiễm. Điện áp quá cao hoặc quá nhiều xung có thể dẫn đến tổn thương tế bào, trong khi điện áp quá thấp có thể không đủ hiệu quả truyền. Chức năng phát hiện trở kháng thông minh của Venid Gene Pulse 830 có thể tự động điều chỉnh các thông số dựa trên điện trở của mẫu, giải quyết vấn đề này một cách hiệu quả. Ngoài ra, nồng độ và thể tích của plasmid tiêm, mức độ phù hợp của các điện cực và tuổi hàng ngày của chuột có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ các điều kiện thí nghiệm.

Triển vọng ứng dụng

Lĩnh vực nghiên cứu cơ bản

Kỹ thuật này có thể được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu chức năng của các gen liên quan đến sự phát triển võng mạc, chẳng hạn như kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR kết hợp với chuyển đổi điện, cho phép loại bỏ hoặc gõ các gen cụ thể của võng mạc để nghiên cứu vai trò của chúng trong sự biệt hóa tế bào võng mạc, hình thành vòng thần kinh; Phân phối siRNA có thể được sử dụng để ức chế biểu hiện gen mục tiêu, khám phá cơ chế của gen trong sự xuất hiện của bệnh võng mạc; Trong nghiên cứu lập trình lại tế bào gốc, công nghệ chuyển đổi điện có thể đưa các yếu tố lập trình lại vào tế bào gốc võng mạc một cách hiệu quả, cung cấp một con đường mới cho nghiên cứu y học tái tạo võng mạc.

Lĩnh vực Translational Medicine

Về điện chuyển khối u sống, có thể nhắm vào các khối u mắt như u nguyên bào võng mạc, thông qua chuyển đổi điện để cung cấp gen hoặc thuốc điều trị, để đạt được liệu pháp nhắm mục tiêu chính xác; Trong quá trình phát triển vắc-xin, công nghệ chuyển đổi điện có thể cung cấp các gen kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch liên quan đến võng mạc, gây ra phản ứng miễn dịch và cung cấp những ý tưởng mới cho nghiên cứu vắc-xin mắt; Về mặt liệu pháp gen trong cơ thể, đối với các bệnh võng mạc di truyền, chẳng hạn như viêm võng mạc sắc tố, melanosis bẩm sinh, v.v., công nghệ chuyển đổi điện có thể đưa các gen bình thường vào các tế bào võng mạc, đặt nền tảng cho các ứng dụng lâm sàng của liệu pháp gen.

Lĩnh vực nông nghiệp và công nghiệp

Trong khi nghiên cứu tập trung vào võng mạc của chuột sơ sinh, ứng dụng rộng rãi của máy đục lỗ dạng sóng vuông Venid Gene Pulse 830 cũng mang lại tiềm năng to lớn trong nông nghiệp và công nghiệp. Trong cải tiến di truyền thực vật, nó có thể được sử dụng để phân phối gen của protosome thực vật, tăng tốc cải tiến giống cây trồng; Trong xây dựng nấm men và kỹ thuật trao đổi chất vi sinh vật, công nghệ chuyển đổi điện có thể thực hiện hiệu quả việc nhập gen ngoại sinh, nâng cao hiệu quả sản xuất của vi khuẩn kỹ thuật.

Với công nghệ xung sóng vuông tiên tiến, hệ thống giám sát thông minh và hỗ trợ dịch vụ kỹ thuật chuyên sâu, máy đục lỗ kiểu sóng vuông Gene Pulse 830 đã trở thành sự lựa chọn đáng tin cậy của hơn 500 tổ chức nghiên cứu hàng đầu. Cho dù đó là hoạt động di truyền chính xác trong nghiên cứu cơ bản hay khám phá liệu pháp sáng tạo trong y học chuyển đổi, thiết bị này cung cấp một nền tảng công nghệ hiệu quả và đáng tin cậy cho các nhà khoa học. Hiện nay, Vinid cung cấp dịch vụ tư vấn chương trình kỹ thuật và thử nghiệm sản phẩm miễn phí, giúp các nhà nghiên cứu phá vỡ các rào cản kỹ thuật để chuyển đổi và thúc đẩy nghiên cứu khoa học đời sống và phát triển các lĩnh vực liên quan.

Tài liệu tham khảo

1. Oxy gây ra những thay đổi trong sự tái tạo mạch máu và biểu hiện gen liên quan đến căng thẳng oxy trong bệnh võng mạc ở chuột sơ sinh [J]. Yu Zengyang, Gong Chen Yuan, Zhang Guoqing. Thông báo dược lý học Trung Quốc. 2014, số 010

Biểu hiện của protein chemogenic-1 monocyte trong mô hình chuột sơ sinh của bệnh võng mạc do oxy gây ra [J]. Tung Ning, Chuligroup, Shorin. Tạp chí mắt thí nghiệm Trung Hoa. 2012, Số 004

3. biểu hiện của protein hóa học monocyte-1 trong mô hình chuột sơ sinh của bệnh võng mạc do oxy gây ra [J]. Tung Ning, Chuligroup, Shorin. Tạp chí mắt thí nghiệm Trung Hoa. 2012, Số 004

Thay đổi biểu hiện và ý nghĩa của MCP-1 trong mô võng mạc của chuột sơ sinh [J]. Đổng Ninh, Chu Lợi Quần, Shorin. Y dược Sơn Đông. 2011, Chương 026

Biểu hiện của MMP-2 trong mô hình chuột sơ sinh của bệnh võng mạc ở trẻ sinh non [J]. Ginger Double, Chen Xiaolong. Báo y học Liêu Ninh. 2009, số 006