Ngày 4 tháng 4 năm 2025, Viện Nghiên cứu Phillips, California, Hoa Kỳ.Giáo sư Kendall W. NettlesvàGiáo sư John R. Yates III là đồng tác giả của một bài báo trên tạp chí Nature Chemical Biology có tựa đề "Nature top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer".Văn bản này đã phát triển một loạiChính sách bảo vệ hàng đầu (nTDP)phức hợp protein ≤70 kDa được sử dụng để xác định các tế bào ung thư vú (bao gồm các mô hình kháng nội tiết biểu hiện quá mức thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), đã được xác định104 Complexoforms của 17 phức hợp protein(Hình thức lắp ráp cụ thể của phức hợp protein). Nghiên cứu phát hiện ra rằng EGFR gây ra sự phân ly của bộ phận vận chuyển hạt nhân 2 (NUTF2), trong khi các vị trí sửa đổi sau dịch K4 và K55 của NUTF2 có ảnh hưởng khác biệt đến việc ức chế con đường tín hiệu thụ thể estrogen (ER). Nghiên cứu cho thấy các đặc điểm phân tử của nhóm protein ung thư vú và vai trò của complexoforms trong sự phát triển khối u và kháng điều trị, cung cấp một cái nhìn mới về cơ chế bệnh và phát triển thuốc.

(Click để xem ảnh lớn)

một

Bối cảnh nghiên cứu

Số liệu mới nhất từ Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế của WHO cho thấy có tới 2,26 triệu trường hợp ung thư vú mới trên toàn thế giới vào năm 2020, vượt qua 2,2 triệu trường hợp ung thư phổi. Ung thư vú đã thay thế ung thư phổi, trở thành bệnh ung thư lớn nhất thế giới. Protein được lắp ráp để tạo thành các phức hợp chức năng thông qua các tương tác không cộng hóa trị, điều khiển gần như tất cả các chức năng quan trọng liên quan đến các khối u ác tính như ung thư vú trong tế bào, trong khi nhiều proteoform được tạo ra bởi các protein do cắt khác biệt, biến đổi trình tự, sửa đổi sau dịch thuật (PTM) hoặc đột biến ảnh hưởng đến sự hình thành, ổn định và hoạt động của các phức hợp chức năng này. Các phương pháp truyền thống của proteomics từ dưới lên có những hạn chế trong việc làm rõ proteoform được tạo ra bởi một protein duy nhất, các phối tử và đồng yếu tố đặc trưng liên kết với phức hợp protein và lập bản đồ các mẫu PTM kết hợp. Sự kết hợp giữa phổ nguyên sinh (Native MS) và protein học từ trên xuống (Top-down Proteomics) của Native Top-down Proteomics (nTDP) tuy có khả năng phân tích cấu trúc, nhưng do sự phong phú thấp của phức hợp protein trong các mẫu sinh học phức tạp, khó phân lập phức hợp protein, thiếu các công cụ tin sinh học để xử lý các bộ dữ liệu nTDP quy mô lớn, nTDP hiện đang được sử dụng chủ yếu trong phân tích phức hợp protein tinh khiết, ít được sử dụng trong các mẫu sinh học phức tạp. Trong các nghiên cứu ung thư vú, tín hiệu yếu tố tăng trưởng là một trong những cơ chế chính của kháng liệu nội tiết, và sự khuếch đại của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và đột biến thành phần tín hiệu hạ lưu có liên quan đến kháng tamoxifen lâm sàng, nhưng cơ chế cụ thể chưa được xác định. Do đó, cần có một cách tiếp cận hiệu quả để nghiên cứu các đặc điểm của protein lắp ráp trong các tế bào ung thư vú để hiểu sâu hơn về cơ chế phân tử của bệnh và thiết kế các loại thuốc hiệu quả, cung cấp nền tảng và động lực cho nghiên cứu phát triển và áp dụng các chiến lược nTDP.

hai

Phương pháp nghiên cứu

1

Đối tượng nghiên cứu:

Các tế bào ung thư vú MCF-7 dương tính với thụ thể estrogen α (ER α) (sau này được gọi là tế bào MCF-7) và các tế bào MCF-7 với thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì quá mức (EGFR) (như một mô hình kháng thuốc cho liệu pháp nhắm mục tiêu ER, tiếp theo là tế bào MCF-7 EGFR).

2

Luồng làm việc nTDP

Quy trình làm việc nTDP do các nhà nghiên cứu phát triển, như được minh họa trong Hình 1, lần đầu tiên được tách ra bằng cách sử dụng sắc ký ngăn chặn kích thước tự nhiên ngoại tuyến (nSEC) để chiết xuất phức hợp protein hòa tan từ tế bào; Thông số kỹ thuật Nano ESI - FAIMSPha lỏng: Easy-nLC 1200, Thiết bị tách hơi: FAIMS, Khối phổ: Orbitrap Fusion LumosPhân tích đặc tính của phức hợp protein native top-down; Sử dụng cuối cùngProSight bản địaPhần mềm kết hợp với sửa chữa thủ công để phân tích dữ liệu chất phổ phức tạp.

Hình 1: nTDP workflow (Nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

ba

Kết quả nghiên cứu

1

Xác minh luồng công việc nTDP

Các nhà nghiên cứu bắt đầu bằng cách sử dụng ba phức hợp protein: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Để kiểm tra tính lặp lại và mạnh mẽ của hệ thống nano-ESI-FAIMS-MSn. Kết quả cho thấy hệ thống có thể ổn định cô lập, phân mảnh phức hợp protein, tạo ra dữ liệu phổ khối có thể làm rõ hiệu quả đặc tính của protein (Hình 2-4). Nó cũng xác minh rằng FAIMS có thể được phân lập trên phức hợp protein cao tới 70 kDa ở mức pha khí. (Hình 5)

Hình 2: Quang phổ nTDP của CA II và các mảnh vỡ của nó được tạo ra bởi ProSight Lite (nhấp vào hình ảnh lớn hơn)

Hình 3: Sơ đồ phổ nTDP của SA và sơ đồ phân mảnh được tạo bởi ProSight Lite (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

Hình 4: Phổ nTDP của AV và biểu đồ phân mảnh được tạo bởi ProSight Lite (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

Hình 5: Sơ đồ di chuyển đỉnh cơ bản của phức hợp protein tiêu chuẩn và giá trị CV của nó

(Click để xem ảnh lớn)

Trượt xuống để xem tất cả

2

Phân tích nTDP MCF-7 và

MCF-7 - Chiết xuất tế bào EGFR

Sau đó, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hệ thống nSEC để phân lập chiết xuất tế bào từ các tế bào ung thư vú (MCF-7 và MCF-7-EGFR), kết quả phổ nSEC cho thấy sự phân lập ổn định và hiệu quả của các phức hợp protein được chiết xuất từ MCF-7 và MCF-7-EGFR (16 thí nghiệm lặp lại). Các phức hợp protein cô lập được phát hiện bằng hệ thống nano-ESI-FAIMS-MSn.104 Complexoforms của 17 phức hợp proteinBao gồm phức hợp protein - kim loại, phức hợp protein - protein - kim loại và phức hợp protein - protein.

Hình 6: Quang phổ nSEC cho các sản phẩm tiêu chuẩn protein và các tập hợp protein trong MCF-7, Keo tập hợp protein trong tế bào MCF-7, Keo tập hợp protein trong MCF-7, Keo tập hợp protein trong MCF-7-EGFR, Keo tập hợp protein trong MCF-7-EGFR. (Click để xem ảnh lớn)

3

Phân tích đặc tính phức hợp protein liên quan đến ung thư vú

• Các dạng phức tạp TPI:TPI là một enzyme glycolysis có liên quan đến ung thư vú và có nghiên cứu cho thấy TPI có thể liên quan đến kháng thuốc, tiến triển khối u và di căn. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy cấu trúc của TPI dimer trong cả tế bào MCF-7 và MCF-7-EGFR với khối lượng phân tử khoảng 53 kDa (nSEC-fraction4). Phức hợp TPI dimer được hình thành từ sự kết hợp của các biến thể monomer bị cắt ngắn và phosphoryl hóa, với hai decamide (N15 và N71) xảy ra trên các biến thể monomer. Các nhà nghiên cứu cũng tìm thấy các phức hợp TPI được hình thành từ các monome TPI đột biến (E104D) và TPI của các tiểu đơn vị monome E104D có thể được phosphoryl hóa, khử amide hóa hoặc acetyl hóa.

Hình 7: Quang phổ nTDP của phức hợp TPI complexoforms trong chiết xuất tế bào MCF-7 (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

• Các dạng phức tạp MIF:MIF là một cytokine đa chức năng liên quan đến sinh học trong một số bệnh ung thư, bệnh tự miễn dịch và viêm, các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng MIF được biểu hiện cao trong cả tế bào MCF-7 và MCF-7 EGFR, và phổ MS1 tự nhiên cung cấp thông tin chi tiết về các thành phần MIF, tạo ra năm cấu trúc bộ ba MIF (đồng nhất và dị sinh). bởi msnPhân tích quang phổ cho thấy các biến thể protein monomer MIF bị cắt ngắn, không biến đổi, nitrit hóa và acetyl hóa (nitrit hóa và acetyl hóa xảy ra trên C80 và K77 tương ứng).

Hình 8: Quang phổ nTDP của phức hợp MIF complexoforms trong chiết xuất tế bào MCF-7 (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

• Các dạng phức tạp SOD1:Enzyme kim loại SOD1 là một chất chống oxy hóa quan trọng cho sự hình thành khối u vú do gen ung thư điều khiển cũng như chuyển đổi superoxide thành O2và H2O2Rất quan trọng. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy cấu trúc dimer SOD1 với khối lượng phân tử khoảng 32 kDa trong các tế bào MCF-7 và MCF-7-EGFR và Cu trong các tiểu đơn vị biến thể protein SOD1 từ cả phổ MS1 (trạng thái tích 11) và phổ MS2 (trạng thái tích 6).2+bởi Zn2+Liên kết không cộng hóa trị của các ion kim loại, biến thể protein SOD1 cũng có acetyl hóa N-terminal, một cặp liên kết disulfide (C57-C111) và loại bỏ methionine N-terminal.

Hình 9: Quang phổ nTDP của phức hợp SOD1 hoàn chỉnh trong chiết xuất tế bào MCF-7 (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

Các dạng phức tạp NUTF2:NUTF2 là một protein dimer làm trung gian vận chuyển nội nhân của enzyme GTP nhỏ Ran. Các nhà nghiên cứu đã xác định được tổng cộng 8 biến thể protein NUTF2 với các kết hợp PTM khác nhau từ các tế bào MCF-7 và MCF-7-EGFR và các đơn vị này được phân phối trong 26 dạng phức hợp khác nhau. Từ biểu đồ phổ MS1, người ta thấy rằng hàm lượng phức hợp dimer NUTF2 nội sinh trong MCF-7-EGFR giảm đáng kể so với các tế bào MCF-7 và isodimer NUTF2 với ba acetyl hóa là duy nhất cho các tế bào MCF-7-EGFR.

Hình 10: Quang phổ nTDP của NUTF2 trong chiết xuất tế bào MCF-7 và MCF-7 - EGFR (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

Hình 11: Thông tin về sức mạnh của các thành phần NUTF2 và proteoforms trong chiết xuất tế bào MCF-7 và MCF-7 - EGFR (nhấp vào để xem hình ảnh lớn hơn)

Trượt xuống để xem tất cả

4

NUTF2 làm trung gian tương tác giữa các con đường EGFR và ER

Kết quả dữ liệu nTDP trước đó cho thấy số lượng dimer NUTF2 trong các tế bào MCF-7-EGFR thấp hơn đáng kể so với các tế bào MCF-7, các nhà nghiên cứu đã sử dụng NUTF2 để kết tủa với hai nhãn ái lực khác nhau.EGFR có thể gây ra sự phân ly dimer của yếu tố vận chuyển hạt nhân 2 (NUTF2)Vị trí biến đổi sau dịch thuật (PTM) của NUTF2 được bảo tồn ở động vật có xương sống và cấu trúc tinh thể của phức hợp protein NUTF2 cho thấy K4 gần vị trí gắn kết nucleoporn. K55 và K63 nằm gần vị trí liên kết Ran, trong đó K55 tham gia vào tiếp xúc qua trung gian nước giữa Ran và NUTF2, do đó các nhà nghiên cứu đã đột biến các vị trí K4 và K55. Kết quả cho thấy,Sự biểu hiện của NUTF2 trong tế bào MCF-7 ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú, sự ức chế này có thể được đảo ngược bởi đột biến K4Q và sự ức chế tăng cường bởi đột biến K55R.Điều này cho thấy các vị trí PTM (K4, K55) có thể điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào bằng cách ảnh hưởng đến sự gắn kết lỗ nhân hoặc tương tác Ran. NUTF2 điều chỉnh gen tăng sinh estrogen GREB1, trong khi đột biến K4Q có thể khôi phục kiểu hình này mà không cần 4OH. Điều này cho thấy các proteoforms NUTF2 tại các vị trí PTM khác nhau dẫn đến các kết quả sinh học khác nhau.

Hình 12: NUTF2 điều chỉnh tín hiệu của ER và ức chế tăng trưởng

(Click để xem ảnh lớn)

Để nghiên cứu thêm về cách NUTF2 điều chỉnh tín hiệu ER và phản ứng với 4OH, phân tích kỹ thuật CUT&RUN đã phát hiện ra rằng các vị trí liên kết ER với NUTF2 trong các tế bào MCF-7 về cơ bản không chồng chéo, nhưng biểu hiện NUTF2 và xử lý 4OH làm thay đổi mô hình liên kết ER. Biểu hiện NUTF2 gây ra sự khác biệt trong sự kết hợp ER ở 1353 vị trí và MCF-7 và MCF-7 sau khi xử lý 4OHNUTF2Các vị trí liên kết ER của tế bào có sự chồng chéo và khác biệt. Nhưng chỉ có 132 bán vị trí gốc ER chung (tức là'1-AGGTCA') được tìm thấy tại các vị trí NUTF2 nhạy cảm với 4OH, cho thấy NUTF2 điều chỉnh tỷ lệ chiếm hữu và hoạt động nhiễm sắc tố ER thông qua một cơ chế gián tiếp. Để hiểu rõ hơn về cơ chế phân tử ức chế tăng trưởng NUTF2, các nhà nghiên cứu đã hoàn thành RNA seq cho các tế bào MCF-7 và MCF-7 NUTF2, phân tích làm giàu gen cho thấy trong hơn 600 gen biểu hiện khác biệt, bao gồm các gen liên quan đến dị hóa RNA điều chỉnh tăng, các thành phần phức hợp NuRD như HDAC1 và các gen apoptosis ERRFI1, các gen liên quan đến phosphoryl hóa ti thể điều chỉnh giảm như BCL2 và các gen gây ung thư như họ RAS. Phân tích làm giàu con đường cho thấy các gen này liên quan đến nhiều loại ung thư và các con đường liên quan đến EGFR, hỗ trợ vai trò của NUTF2 như một yếu tố hiệu ứng tín hiệu EGFR. Các nghiên cứu về proteomics lân cận của ERα-APEX2 đã chỉ ra rằng biểu hiện NUTF2 làm thay đổi các nhóm tương tác của ER, bao gồm tăng dấu hiệu JunB, giảm dấu hiệu ức chế khối u HSPBP1 và CSDE1. So sánh các tế bào NUTF2:WT với NUTF2:K4Q, sự khác biệt trong nhóm tương tác ER đã được tìm thấy (chẳng hạn như tăng nhãn CNOT9 và giảm nhãn DNMT3A), xác nhận thêm rằng NUTF2 ảnh hưởng đến con đường bằng cách điều chỉnh tương tác protein liên quan đến ER.

Hình 13: Tương tác NUTF2-ER

(Click để xem ảnh lớn)

bốn

Kết luận và ý nghĩa

1

Xây dựng và áp dụng thành công phương pháp nTDP

Nghiên cứu tối ưu hóa nTDP workflow, kết hợp với sắc ký kháng bài trừ kích thước gốc ngoại tuyến (nSEC), ion hóa phun điện nano (nano-ESI), phổ di chuyển ion bất đối xứng trường (FAIMS) và phổ khối song song đa giai đoạn (MSn), đã xác định thành công 104 phức hợp protein của 17 phức hợp từ các tế bào ung thư vú (MCF-7 và MCF-7-EGFR), bao gồm phức hợp protein-kim loại, phức hợp protein-protein-kim loại, phức hợp protein-protein, v.v., và có thể mô tả đặc điểm của ≤70 kDa, vượt qua sự kết hợp protein nội sinh truyền thống.Phương pháp phân tích giới hạn của phức hợp protein phong phú thấp trong các mẫu sinh học phức tạp.

2

Khám phá và phân tích chức năng của các phức hợp protein quan trọng

Các phức hợp protein quan trọng liên quan đến ung thư đã được xác định, chẳng hạn như isomerase phosphate propionate (TPI), các yếu tố ức chế di chuyển đại thực bào (MIF), các phức hợp của superoxide dismutase (SOD1), làm rõ các trang web sửa đổi sau dịch thuật (PTM) của chúng (ví dụ như khử amide của TPI, phosphoryl hóa, nitrit hóa MIF, acetyl hóa, các trang web liên kết kim loại của SOD1, v.v.) và ảnh hưởng của chúng đối với cấu trúc và chức năng của phức hợp. Phát hiện cốt lõi: Sự biểu hiện quá mức EGFR gây ra sự phân ly dimer của yếu tố vận chuyển hạt nhân 2 (NUTF2). Các dimer NUTF2 tham gia vào đầu vào hạt nhân của RAN như các protein con thoi lỗ nhân và biểu hiện quá mức của chúng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú, trong khi các đột biến ở các vị trí PTM khác nhau (K4 và K55) đảo ngược hoặc làm trầm trọng thêm hiệu ứng ức chế này, cho thấy PTM của NUTF2 ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư vú bằng cách điều chỉnh con đường tín hiệu thụ thể estrogen (ER).

3

Cơ chế liên kết giữa NUTF2 và kháng nội tiết trong ung thư vú

NUTF2 ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú bằng cách ảnh hưởng đến con đường tín hiệu ER bằng cách gián tiếp điều chỉnh mạng lưới liên kết DNA và tương tác protein của ER, chẳng hạn như điều chỉnh gen tăng sinh estrogen GREB1 và điều chỉnh gen apoptosis ERRFI1, v.v. Sự biểu hiện quá mức EGFR (mô hình kháng liệu pháp nội tiết) làm giảm mức độ dimer NUTF2, thay đổi mô hình PTM của nó, dẫn đến hiệu ứng điều hòa bất thường của NUTF2 đối với tín hiệu ER và có thể là một trong những cơ chế quan trọng của kháng tamoxifen qua trung gian EGFR.

4

Ý nghĩa của nTDP

Phương pháp này cung cấp một mô hình mới để phân tích quy mô lớn các phức hợp protein nội sinh trong các mẫu sinh học phức tạp, có khả năng bảo tồn các tương tác không cộng hóa trị mong manh, mô tả chính xác PTM, mô hình lắp ráp và liên kết phối tử của proteoform, mở ra những con đường mới cho sinh học ung thư, khám phá mục tiêu dược phẩm và nghiên cứu sinh học cấu trúc, đặc biệt là hiểu biết quan trọng về cơ chế phân tử của kháng điều trị ung thư vú.

Nếu cần hợp tác tải lại bài viết này, xin vui lòng để lại lời nhắn cuối bài viết.