Nhiễm khuẩn gây bệnh là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là trong các vết thương mãn tính và cấp tính, nơi vi khuẩn xâm lấn và sự hình thành màng sinh học làm cho việc chữa lành vết thương trở nên khó khăn hơn. Với lợi thế về hoạt động kháng khuẩn phổ rộng và kháng thuốc thấp, liệu pháp dựa trên oxy phản ứng (ROS) hiện là một chiến lược không kháng sinh để điều trị vết thương nhiễm trùng. Tuy nhiên, ứng dụng lâm sàng của nó vẫn bị hạn chế bởi các vấn đề như hiệu quả quản lý thấp, nhắm mục tiêu vi khuẩn kém và viêm không kiểm soát được sau khi điều trị.

Để đạt được mục tiêu này, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Lê Uy, Trường Dược Đại học Vũ Hán, đã thiết kế một miếng vá microneedling hai lớp đa chức năng (LFT/S-MN) được thiết kế để khử trùng hiệu quả và thúc đẩy chữa lành vết thương. Bản vá này liên kết các hạt nano dựa trên lactoferrin tích điện dương (LFT NP) với các chất nhạy âm porphyrin (TAPPFe), được đặt trong một lớp nền hòa tan trong khi thuốc chống viêm spermidine (SPD) được nạp trong lớp kim phản ứng pH. Khi microneedling được đưa vào các mô bị nhiễm bệnh, các NP LFT được giải phóng có thể nhắm mục tiêu hiệu quả và tập hợp các vi khuẩn tích điện âm, tạo ra một lượng lớn ROS dưới sự kích thích siêu âm thông qua liệu pháp hòa âm hóa học phối hợp (CDT/SDT). Đồng thời, vi môi trường axit của vết thương kích hoạt sự suy thoái dần dần của lớp kim tiêm, cho phép giải phóng SPD có kiểm soát, điều hòa miễn dịch. Trong mô hình vết thương trên chuột bị nhiễm Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), miếng dán LFT/S-MN làm giảm đáng kể tải vi khuẩn, ức chế phản ứng viêm, thúc đẩy sự lắng đọng collagen và hình thành mạch máu mới, và tăng tốc độ đóng vết thương.

Công trình này đề xuất một chiến lược không kháng sinh đầy hứa hẹn để đạt được kháng khuẩn vết thương và tái tạo mô thông qua CDT/SDT phối hợp và điều hòa viêm. Bản vá microneedling này sử dụng công nghệ in li-tô lập thể vi mô (PμSL) được chiếu chính xác bằng cách sử dụng mosque (microArch) ® S240， Độ chính xác: 10μm) Các kết quả nghiên cứu được công bố trên tạp chí Journal of Controlled Release với tiêu đề "Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing". Nghiên cứu tiến sĩ cấp 2023 của Học viện Dược Đại học Vũ Hán Ginger Peng là tác giả của luận án, Giáo sư Lê Uy là tác giả của thông tin luận án, Học viện Dược Đại học Vũ Hán là đơn vị hoàn thành luận án, công tác nghiên cứu trên đã được hỗ trợ bởi dự án Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia và kinh phí PI của Trung tâm Y tế Đời sống Taikang Đại học Vũ Hán.

Như thể hiện trong Hình 1, miếng vá tích hợp các hạt nano lactoferrin tích điện dương (LFT NP) được kết nối với chất nhạy âm porphyrin (TAPPFe) trong lớp cơ sở hòa tan, cũng như các đỉnh phản ứng pH của chất chống viêm spermine (SPD). Sau khi chèn vào mô bị nhiễm, NP LFT được giải phóng có hiệu quả nhắm mục tiêu và tích tụ vi khuẩn tích điện âm, do đó tạo ra ROS mạnh mẽ thông qua liệu pháp hóa học và âm động học phối hợp (CDT/SDT) dưới sự kích thích siêu âm. Trong khi đó, vi môi trường vết thương có tính axit kích hoạt sự suy thoái dần dần của các lớp đầu và giải phóng SPD có kiểm soát để điều hòa miễn dịch. Trong mô hình vết thương trên chuột bị nhiễm Pseudomonas aeruginosa, miếng dán LFT/S-MN làm giảm đáng kể tải lượng vi khuẩn, ức chế viêm, thúc đẩy sự lắng đọng collagen và hình thành mạch máu mới, và tăng tốc độ đóng vết thương.

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc và cơ chế điều trị của miếng dán LFT/S-MN để điều trị vết thương bị nhiễm trùng. (A) Thiết kế và chuẩn bị các bản vá LFT/S-MN hai lớp bao gồm một lớp cơ sở hòa tan với tải điện tích dương LFT NP và một lớp đầu phản ứng pH với SPD đóng gói. (B) Sau khi chèn vết thương nhiễm trùng, lớp cơ bản nhanh chóng hòa tan giải phóng các NP LFT, tích cực nhắm mục tiêu vi khuẩn tích cực và tạo ROS theo Hoa Kỳ thông qua SDT và CDT phối hợp để loại bỏ vi khuẩn hiệu quả. Đồng thời, vi môi trường vết thương có tính axit kích hoạt sự thoái hóa của lớp đỉnh, dẫn đến sự giải phóng liên tục của SPD để điều chỉnh viêm. Chiến lược kết hợp này thúc đẩy loại bỏ vi khuẩn, điều hòa miễn dịch và tái tạo mô, cuối cùng đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương.

Để đạt được tính cụ thể của vị trí và kiểm soát phát hành thuốc, các bản vá MN hai lớp đáp ứng pH, được gọi là bản vá LFT/S-MN, đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng chiến lược tạo mẫu tuần tự. Để hình dung và xác minh cấu trúc, hai đầu dò huỳnh quang, albumin huyết thanh gia súc được dán nhãn Rhodamine B (RhB-BSA) và huỳnh quang isothiocyanate (FITC), được nạp vào các lớp đầu và đáy của các hạt nano tương ứng (Hình 2A và B). Lớp đầu được tổng hợp bằng cách trùng hợp gốc tự do gây ra tia cực tím và liên kết chéo siffron giữa chitosan methyl acrylic (CSMA) và SPDTA, với lớp nền bao gồm 18 wt% rượu polyethylene (PVA) và dung dịch sucrose, với lớp lót bao gồm 20 wt% polystyrene (PS). Phân tích phổ năng lượng tia X phân tán năng lượng (EDS) (Hình 2C) cho thấy các nguyên tố sắt từ các NP LFT được phân bố đồng đều và giới hạn ở các lớp cơ bản, trong khi các nguyên tố carbon ở các lớp nhọn được phân bố đồng đều, cho thấy sự tách biệt không gian rõ rệt. Bản vá LFT/S-MN thu được bao gồm một mảng 10×10 MN kéo dài khoảng 0,5 cm2 (Hình 2D). Mỗi cây kim có hình dạng hình nón rõ ràng, cao khoảng 850 μm và có cấu trúc hai lớp rõ rệt (Hình 2E và F). Các thử nghiệm cơ học cho thấy lực gãy của mỗi kim là khoảng 4N (Hình 2G), đủ để chèn qua da hiệu quả và ứng dụng lâm sàng tiềm năng.

Hình 2. Đặc tính của bản vá LFT/S-MN. (A-B) Hình ảnh trường sáng và huỳnh quang đại diện của miếng dán LFT/S-MN minh họa tính toàn vẹn cấu trúc và đánh dấu huỳnh quang của các thành phần pha trộn. (C) Biểu đồ phổ năng lượng xác nhận sự phân bố của các phần tử trong MN. (D) Hình ảnh quang học và (E, F) hình ảnh SEM cho thấy hình dạng của LFT/S-MN. Đường chấm màu vàng đại diện cho giao diện giữa lớp nhọn phản ứng ph và lớp cơ sở có thể hòa tan. (G) Đường cong dịch chuyển lực của LFT/S-MN cho thấy độ bền cơ học của chúng phù hợp với sự thâm nhập của da.

Sử dụng da lợn ly thể để đánh giá khả năng thâm nhập da của miếng dán LFT/S-MN. Sau khi áp dụng, MN đã phá vỡ thành công lớp biểu bì và vận chuyển thuốc nhuộm huỳnh quang đóng gói vào da, hiển thị hình ảnh huỳnh quang (Hình 3A) và mặt cắt ngang mô học được xác nhận (Hình 3B). Hành vi hòa tan và giải phóng tiếp theo của các NP LFT được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Lớp nền hòa tan trong PBS (pH 7.4) trong vòng 80 giây, tạo điều kiện giải phóng nhanh chóng các NP LFT từ cơ sở MN, như thể hiện trong Hình 3C. Xem xét vi môi trường vết thương bị nhiễm trùng thường có tính axit, các tác giả đã nghiên cứu thêm về hành vi phản ứng pH ở đầu MN. Các nghiên cứu phát hành in vitro cho thấy sự suy thoái dần dần của lớp chóp trong điều kiện axit nhẹ (pH 5,6) và gần như phân hủy vào ngày 15, trong khi sự suy thoái tối thiểu xảy ra ở điều kiện trung tính (pH 7,4) (Hình 3D), cho thấy hành vi nhạy cảm với axit của lớp chóp. Xác định định lượng hiệu quả tải và phân phối thuốc (Hình 3E và F). LFT là 145,43 ± 2,76 μg và SPD là 14,96 ± 0,08 μg. Sau khi dùng qua da, LFT được dùng qua MN với liều 132,83 ± 2,91 μg và SPD được dùng qua MN với liều 14,38 ± 0,22 μg, cả hai đều có hiệu quả hơn 90%. Ngoài ra, sự giải phóng tích lũy của SPD trong điều kiện axit (pH 5.6) đạt 88,87 ± 3,58% vào ngày thứ 15, cao hơn đáng kể so với PBS (pH 7.4), tiếp tục xác nhận phổ giải phóng phản ứng axit của MN tip (Hình 3G).

Hình 3. Đánh giá phát hành thuốc của bản vá LFT/S-MN. (A) Trường sáng đại diện và hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang của da ly thể của lợn sau khi cấy miếng dán LFT/S-MN. (B) Cắt mô học da lợn sau khi cấy bản vá MN. (C) Hình ảnh quang học cho thấy sự tan rã nhanh chóng của lớp cơ bản và sự tách biệt của lớp đỉnh trong PBS trong vòng 80 giây. (D) Hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược được hiển thị trong các điều kiện pH khác nhau (pH 7,4 và 5,6), mô phỏng môi trường vết thương trung tính và axit nhẹ, MN phân hủy trong vòng 15 ngày. (E) LFT/S-MN Patch Định lượng tải và phân phối LFT. (F) Định lượng tải và phân phối SPD vá LFT/S-MN. (G) Đường cong giải phóng tích lũy in vitro của SPD theo thời gian trong LFT/S-MN. Dữ liệu được biểu diễn bằng mean ± SD (n=3 mẫu độc lập).

Các tác giả đã đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của miếng dán LFT/S-MN một cách có hệ thống. Như thể hiện trong Hình 4D, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với LFT dưới chiếu xạ siêu âm (3 MHz, 0,97 W/cm2, chu kỳ nhiệm vụ 50%, 30 phút) là 128 μg/mL. Các miếng vá LFT/S-MN riêng lẻ cho thấy hoạt tính kháng khuẩn vừa phải với tỷ lệ ức chế Staphylococcus aureus là 36,41 ± 0,75% và Pseudomonas aeruginosa là 35,87 ± 1,48% (Hình 4A và E). Ngược lại, sau khi kích hoạt siêu âm, tỷ lệ kìm khuẩn của miếng dán LFT/S-MN được cải thiện đáng kể, lần lượt là 99,95 ± 0,04% và 99,96 ± 0,04% (Hình 4E), cho thấy vi khuẩn gần như bất hoạt. Những kết quả này được xác nhận thêm bằng cách nhuộm SYTO 9/PI, trong đó nhóm LFT/S-MN Hoa Kỳ cho thấy huỳnh quang đỏ chính cho thấy sự chết của vi khuẩn trên diện rộng (Hình 4B và F). Kính quét điện (SEM) cung cấp thêm bằng chứng hình thái; Vi khuẩn trong nhóm không được điều trị duy trì một màng hoàn chỉnh và mịn màng, trong khi vi khuẩn tiếp xúc với siêu âm kích hoạt LFT/S-MN cho thấy sự phá hủy cấu trúc đáng kể và vỡ màng (Hình 4C). Nhìn chung, những phát hiện này xác nhận rằng sau khi kích hoạt siêu âm, miếng dán LFT/S-MN có thể tạo ra một lượng lớn ROS cục bộ, do đó tiêu diệt vi khuẩn hiệu quả tại vị trí tổn thương.

Hình 4. Nghiên cứu tính chất kháng khuẩn in vitro của miếng dán LFT/S-MN. (A) Một bức ảnh đại diện của tấm thạch cho thấy tác dụng kháng khuẩn của LFT/S-MN chống lại Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. (B) Hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang cho thấy Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa tạo ra stress oxy hóa do ROS trong các điều kiện xử lý khác nhau. (C) Hình ảnh SEM về hình thái vi khuẩn sau khi xử lý cho thấy sự phá hủy màng và biến dạng cấu trúc của Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. (D) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của LFT đối với Staphylococcus aureus trong LFT/S-MN cho thấy hoạt động kháng khuẩn phụ thuộc vào liều. Mũi tên màu đỏ đại diện cho giá trị MIC của LFT. (E) Phân tích định lượng sức sống của vi khuẩn sau khi xử lý khác nhau, đánh giá bằng nhuộm sống/chết. (F) Kết quả đo cường độ huỳnh quang màu xanh lá cây (FI) tương ứng trong thí nghiệm sống/chết tiếp tục xác nhận tác dụng kháng khuẩn. Dữ liệu được hiển thị có nghĩa là ± SD (n=3 mẫu độc lập). ** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。 ns có nghĩa là không có ý nghĩa.

Để kiểm tra hiệu quả điều trị nội tạng của miếng dán LFT/S-MN, các tác giả sử dụng Pseudomonas aeruginosa (Chủng tộc P. aeruginosa) Xây dựng mô hình nhiễm trùng vết thương trên da chuột (Hình 5A). Những con chuột bị nhiễm bệnh được chia ngẫu nhiên thành 8 nhóm (mỗi nhóm n=5), bao gồm nhóm không siêu âm (Blank, S-MN, LF/S-MN, LFT/S-MN) và nhóm siêu âm (Blank+US, S-MN+US, LF/S-MN+US, LFT/S-MN+US). Phác đồ siêu âm bao gồm chiếu xạ hàng ngày 3 MHz, 0,97 W/cm2, chu kỳ nhiệm vụ 50%, 30 phút trong 3 ngày liên tiếp. Theo dõi sự tiến triển của vết thương bằng cách chụp ảnh vào ngày 0, 1, 3, 5 và 9 sau khi điều trị (Hình 5B). Vào ngày đầu tiên, sự tiết mủ giảm đáng kể trong nhóm LFT/S-MN+US, phản ánh tác dụng kháng khuẩn kết hợp của CDT và SDT. Ngược lại, nhóm không siêu âm cho thấy nhiễm trùng huyết và viêm rộng hơn. Vào ngày thứ 3, sau khi hoàn thành chính quyền siêu âm, các mẫu giường vết thương được thu thập để nuôi cấy vi khuẩn, đánh giá tải vi khuẩn còn lại (Hình 5E). Số lượng đĩa cho thấy nhóm LFT/S-MN+US hình thành ít nhất, cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh hơn trong cơ thể (Hình 5F). Vào ngày thứ 9, những con chuột được điều trị bằng LFT/S-MN+US có tỷ lệ chữa lành vết thương cao và tái tạo mô rõ rệt (Hình 5C). Trong suốt quá trình điều trị, theo dõi cân nặng cho thấy không có biến động đáng kể giữa các nhóm (Hình 5D), cho thấy khả năng tương thích sinh học toàn thân tốt của các miếng dán MN. Kết hợp với nhau, những kết quả này cho thấy LFT/S-MN, kết hợp với siêu âm, có hiệu quả trong việc loại bỏ nhiễm trùng do vi khuẩn và tăng tốc đáng kể việc chữa lành vết thương trong cơ thể.

Hình 5. Tác dụng kháng khuẩn trong cơ thể và đặc tính chữa lành vết thương của miếng dán LFT/S-MN. (A) Sơ đồ mô hình vết thương ở chuột bị nhiễm Pseudomonas aeruginosa và chiến lược điều trị bằng cách sử dụng miếng dán MN có hoặc không có kích thích của Hoa Kỳ. (B) Hình ảnh đại diện của vị trí vết thương vào ngày 0, 1, 3, 5 và 9 sau khi điều trị. Một cuộn dây ảo màu đen biểu thị ranh giới vết thương ban đầu. (C) Phân tích định lượng chữa lành vết thương theo thời gian cho từng nhóm điều trị (n=5). Theo dõi cân nặng của chuột trong quá trình điều trị (n=5). (E) Ảnh chụp tấm thạch của khuẩn lạc vi khuẩn nuôi cấy giường vết thương vào ngày thứ 3 của các nhóm. (F) Định lượng sức sống của vi khuẩn (n=3) dựa trên phân tích Đơn vị hình thành thuộc địa (CFU). Dữ liệu có nghĩa là ± SD. *** p < 0.001，**** p < 0.0001。 ns có nghĩa là không có ý nghĩa.

Kết luận:Nghiên cứu này đã phát triển thành công một miếng vá microneedling hai lớp (LFT/S-MN) đáp ứng pH, đạt được điều trị hiệu quả cao cho vết thương bị nhiễm trùng bằng cách tích hợp liệu pháp kháng khuẩn phối hợp được kích hoạt bằng siêu âm (CDT/SDT) với điều hòa miễn dịch được kích hoạt bởi vi môi trường axit. Bản vá không chỉ giải phóng nhanh các NP LFT nhắm mục tiêu vi khuẩn, tạo ra một lượng lớn ROS dưới siêu âm để loại bỏ vi khuẩn và màng sinh học, mà còn liên tục giải phóng SPD trong điều kiện axit của vết thương, điều chỉnh phân cực đại thực bào và ức chế viêm quá mức. Các thí nghiệm in vivo đã xác nhận rằng chiến lược này có thể đẩy nhanh đáng kể việc đóng vết thương, thúc đẩy tái tạo mô và có tính an toàn sinh học tuyệt vời. Công trình này cung cấp một chiến lược mới với tiềm năng biến đổi lâm sàng cho việc điều trị vết thương nhiễm trùng không phụ thuộc vào kháng sinh và tái tạo mô.