Máy đo PCR định lượng huỳnh quang (qPCR) là thiết bị cốt lõi trong các lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử, chẩn đoán lâm sàng (như phát hiện coronavirus mới) và độ chính xác của nó ảnh hưởng trực tiếp đến độ tin cậy của kết quả thí nghiệm. Hiệu chỉnh (hiệu chuẩn) là bước quan trọng để đảm bảo hiệu suất ổn định của máy đo qPCR, đòi hỏi phải thường xuyên kiểm tra và điều chỉnh hệ thống hệ thống điều khiển nhiệt độ (độ chính xác kiểm soát nhiệt độ) và hệ thống quang học (phát hiện tín hiệu huỳnh quang).

Mục tiêu cốt lõi của việc điều chỉnh

Việc điều chỉnh thiết bị qPCR được thiết kế để đảm bảo rằng các chỉ số hiệu suất chính sau đây tuân thủ các yêu cầu:

Hệ thống điều khiển nhiệt độ: lỗi hiển thị nhiệt độ (độ lệch của nhiệt độ thiết lập so với nhiệt độ thực tế), độ đồng nhất nhiệt độ (chênh lệch nhiệt độ giữa các lỗ phản ứng), biến động nhiệt độ (thay đổi nhiệt độ theo thời gian), nhiệt độ tối đa quá xung (biên độ vượt quá giá trị thiết lập trong quá trình ấm lên/làm mát), tốc độ làm mát trung bình (tốc độ ấm lên/làm mát).

Hệ thống quang học: độ chính xác cường độ huỳnh quang (tính nhất quán của tín hiệu huỳnh quang trong cùng một lỗ), số chu kỳ ngưỡng (giá trị Ct) độ chính xác (tính nhất quán của các giá trị Ct trong các lỗ khác nhau), nhiệt độ nóng chảy (giá trị Tm) trôi dạt (độ lệch nhiệt độ khi cường độ huỳnh quang giảm một nửa), hệ số tương quan tuyến tính huỳnh quang (mối quan hệ tuyến tính giữa cường độ huỳnh quang và nồng độ axit nucleic).

II. Chuẩn bị trước khi điều chỉnh

1. Điều kiện môi trường

Nhiệt độ: 15-30 ℃ (tránh biến động nhiệt độ ảnh hưởng đến kết quả hiệu chuẩn);

Độ ẩm tương đối: 20-85% RH (ngăn chặn độ ẩm của dụng cụ);

Nguồn điện: Điện áp ổn định (UPS được khuyến nghị) để tránh mất điện ảnh hưởng đến quá trình hiệu chuẩn.

2. Thiết bị và vật liệu

Chất tiêu chuẩn: yêu cầu sử dụng chất tiêu chuẩn đã được chứng nhận (ví dụ: DNA plasmid, chất tiêu chuẩn axit ribonucleic), giá trị số lượng đặc tính (số bản sao ≥10⁶ copies/μL) và độ không chắc chắn mở rộng tương đối (≤5%) phải đáp ứng các yêu cầu của JJF (Zin) 04-2020;

Thiết bị hiệu chuẩn: mô phỏng quang học (cảm biến nhiệt độ tích hợp với máy phát quang phát ra, phạm vi đo nhiệt độ 0-120 ℃, sai số cho phép tối đa ± 0,1 ℃; bước sóng ánh sáng phát ra 360-780 nm, cường độ bức xạ ánh sáng tương đối có thể điều chỉnh), máy kiểm tra nhiệt độ đa kênh (như JDPC-96, để đo chênh lệch nhiệt độ giữa các lỗ phản ứng);

Vật tư tiêu hao: tấm hiệu chuẩn đặc biệt (chẳng hạn như tấm hiệu chuẩn ROI AB7500, tấm hiệu chuẩn nền), pipet (2μL, 10μL, v.v., cần kiểm tra đo lường để đạt tiêu chuẩn), găng tay không bột (tấm hiệu chuẩn ngăn ngừa ô nhiễm).

III. Quy trình chính để điều chỉnh

Quy trình hiệu chỉnh máy đo qPCR cần tuân thủ nghiêm ngặt JJF (Zin) 04-2020 "Thông số kỹ thuật hiệu chuẩn máy đo định lượng huỳnh quang thời gian thực", chủ yếu bao gồm hiệu chuẩn hệ thống nhiệt độ và hiệu chuẩn hệ thống quang học hai phần, sau đây lấy thiết bị dòng AB7500 làm ví dụ để giải thích các bước cụ thể:

(I) Hiệu chuẩn hệ thống nhiệt độ

Nhiệt độ là tham số trung tâm của phản ứng qPCR và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả khuếch đại DNA. Hiệu chuẩn hệ thống nhiệt độ yêu cầu sử dụng mô phỏng quang học (ống phản ứng thay thế) để mô phỏng sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng thực tế và xác minh hiệu suất kiểm soát nhiệt độ của thiết bị.

1. Chuẩn bị trước khi hiệu chuẩn

Kết nối mô phỏng quang học với máy đo qPCR, đảm bảo cảm biến nhiệt độ bên dưới tiếp xúc tốt với nguồn sáng phát huỳnh quang phía trên và khối nhiệt của thiết bị;

Áp dụng dầu dẫn nhiệt dưới mô phỏng quang học, tăng cường dẫn nhiệt;

Mở Instrument Software, chọn module "Calibration" và vào chương trình "Temperature Calibration".

2. Quy trình hiệu chuẩn

Làm nóng trước: đặt nhiệt độ thiết bị là 23 ℃, chạy chương trình làm nóng trước (khoảng 10 phút), để thiết bị đạt trạng thái ổn định;

Cài đặt điểm nhiệt độ: chọn 9 điểm nhiệt độ (30 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 90 ℃, 95 ℃), mỗi điểm kéo dài 2 phút (để đo lỗi hiển thị nhiệt độ, độ đồng nhất, độ biến động);

Quá trình làm nóng/làm mát: từ 50 ℃ đến 90 ℃ (đo tốc độ làm nóng trung bình) và từ 90 ℃ đến 50 ℃ (đo tốc độ làm mát trung bình);

Thu thập dữ liệu: Thiết bị tự động ghi lại nhiệt độ thiết lập (Ts), trung bình nhiệt độ thực tế (T₁), biến động nhiệt độ (T_v), xung tối đa (T_os) tại mỗi điểm nhiệt độ.

3. Tính toán kết quả

Lỗi hiển thị nhiệt độ: △ T=Ts - T₁ (yêu cầu ≤ ± 0,5 ℃);

Độ đồng nhất nhiệt độ: △ Tu=T_umax - T_umin (T_umax là nhiệt độ tối đa của tất cả các lỗ, T_umin là tối thiểu, yêu cầu ≤1,0 ℃);

Biến động nhiệt độ: △ T_v=± (T_max - T_min)/2 (T_max là tối đa nhiệt độ lỗ đơn, T_min là tối thiểu, yêu cầu ≤0,2 ℃);

Nhiệt độ vượt quá tối đa: △ T_os=Tosmax - Ts (Tosmax là giá trị vượt quá tối đa cho tất cả các lỗ, yêu cầu ≤3,0 ℃);

Tốc độ ấm lên trung bình: v_up=(TB - TA)/tut (TB là trung bình điểm nhiệt độ 90 ℃, TA là trung bình điểm nhiệt độ 50 ℃, tut là thời gian ấm lên, yêu cầu ≥4 ℃/giây);

Tốc độ làm mát trung bình: v_down=(TB - TA)/tdo (tdo là thời gian làm mát, yêu cầu ≥3 ℃/giây).

(ii) Hiệu chuẩn hệ thống quang học

Hệ thống quang học chịu trách nhiệm phát hiện tín hiệu huỳnh quang, độ chính xác của nó ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng của giá trị Ct và nồng độ axit nucleic. Hiệu chuẩn hệ thống quang học yêu cầu sử dụng một tấm hiệu chuẩn đặc biệt (chẳng hạn như tấm hiệu chuẩn ROI AB7500) để điều chỉnh độ nhạy của máy dò huỳnh quang phù hợp với tín hiệu.

1. Hiệu chuẩn nền

Mục đích: loại bỏ sự can thiệp của huỳnh quang cơ bản của thiết bị (chẳng hạn như tín hiệu điện tử, ô nhiễm vật tư tiêu hao nhựa);

Bước:

(1) Lấy tấm hiệu chuẩn nền ra (cần đặt ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để tránh ngưng tụ);

(2) Nạp bảng hiệu chuẩn vào dụng cụ, chạy chương trình "hiệu chuẩn nền" (khoảng 30 phút);

(3) Phần mềm tự động ghi lại tín hiệu huỳnh quang nền để tạo tệp sửa nền (tự động khấu trừ trong các thí nghiệm tiếp theo).

2. Hiệu chuẩn ROI (Khu vực quan tâm)

Mục đích: ánh xạ các vị trí lỗ trên tấm phản ứng với máy dò dụng cụ để đảm bảo rằng tín hiệu huỳnh quang của mỗi lỗ được thu thập chính xác;

Bước:

(1) Lấy bảng hiệu chuẩn ROI ra (bảng tiêu chuẩn hoặc bảng nhanh, cần 5 giây và ly tâm trong 2 phút);

(2) Nạp bảng hiệu chuẩn vào dụng cụ, chạy chương trình "hiệu chuẩn ROI";

(3) Phần mềm tự động chụp ảnh của từng bộ lọc, tạo mặt nạ ROI (vòng tròn màu xanh lá cây được hiển thị xung quanh mỗi lỗ cho thấy hiệu chuẩn thành công);

(4) Nếu hình ảnh quá bão hòa (huỳnh quang trong lỗ quá mạnh), cần điều chỉnh thời gian phơi sáng (ví dụ: giảm từ 2048 xuống 1024) để thu lại hình ảnh.

3. Hiệu chuẩn quang học

Mục đích: bù đắp cho các hiệu ứng vật lý của hệ thống quang học (chẳng hạn như phản ứng quang phổ của bộ lọc), đảm bảo độ chính xác của tín hiệu huỳnh quang;

Bước:

(1) Chọn chương trình "Hiệu chuẩn quang học", tải tệp hiệu chuẩn ROI;

(2) Chạy chương trình (khoảng 10 phút), phần mềm tự động phân tích các đặc điểm phổ của tín hiệu huỳnh quang để tạo ra các tập tin tích cực quang học.

4. Hiệu chuẩn thuốc nhuộm

Mục đích: Xác minh độ chính xác của tín hiệu huỳnh quang của các loại thuốc nhuộm khác nhau (ví dụ: FAM, VIC, ROX), đảm bảo độ tin cậy của các thí nghiệm đa thuốc nhuộm;

Bước:

(1) Loại bỏ bảng hiệu chuẩn thuốc nhuộm (chứa nhiều loại thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như CY3, CY5, FAM, v.v.);

(2) Nạp bảng hiệu chuẩn vào dụng cụ, chạy chương trình "hiệu chuẩn thuốc nhuộm";

(3) Phần mềm tự động thu thập quang phổ huỳnh quang của từng loại thuốc nhuộm để tạo tài liệu hiệu chỉnh thuốc nhuộm (tự động xác định tín hiệu thuốc nhuộm trong các thí nghiệm tiếp theo).

c) Hồ sơ kết quả và giấy chứng nhận

Sau khi hiệu chuẩn hoàn tất, cần có giấy chứng nhận hiệu chuẩn CNAS, bao gồm:

(1) Thông tin cơ bản về thiết bị (mô hình, số sê-ri, nhà sản xuất);

(2) Hiệu chỉnh điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian);

(3) Kết quả hiệu chuẩn (lỗi hiển thị nhiệt độ, độ đồng nhất, độ chính xác của hệ thống quang học, v.v.);

d) Chữ ký của nhân viên hiệu chuẩn và nhân viên kiểm toán;

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

IV. Chú ý điều chỉnh

1. Hiệu chuẩn chu kỳ

Đề nghị hiệu chuẩn toàn diện 12 tháng một lần (phù hợp với yêu cầu của JJF (JIN) 04-2020);

Với tần suất sử dụng cao (ví dụ: chạy nhiều hơn 10 lần mỗi ngày) hoặc các ứng dụng quan trọng (ví dụ: chẩn đoán lâm sàng), có thể giảm xuống còn 6 tháng một lần;

Sau khi thiết bị được di dời, sửa chữa hoặc thay thế các thành phần quan trọng (ví dụ: khối sưởi ấm, máy dò), nó cần được hiệu chuẩn lại.

2. Hỗ trợ chuyên nghiệp

Hiệu chuẩn phải được thực hiện bởi các kỹ sư của nhà máy hoặc các tổ chức bên thứ ba có trình độ (chẳng hạn như Viện Khoa học Kiểm tra và Giám sát Đo lường Thiên Tân) để đảm bảo tuân thủ SOP (quy trình vận hành tiêu chuẩn);

Các chuyên gia không được phép tự điều chỉnh các thông số của thiết bị (ví dụ: cài đặt nhiệt độ, bộ lọc quang học) để không ảnh hưởng đến kết quả hiệu chuẩn.

3. Xác minh sau khi hiệu chuẩn

Sau khi hiệu chuẩn hoàn thành, cần chạy các thí nghiệm xác minh chất tiêu chuẩn (ví dụ như chất chuẩn DNA plasmid) để kiểm tra độ lặp lại của giá trị Ct (hệ số biến thể ≤3%) và hệ số tương quan tuyến tính (R² ≥0,99), đảm bảo hiệu quả hiệu chuẩn;

Nếu kết quả kiểm tra không phù hợp yêu cầu, cần hiệu chỉnh lại hoặc liên hệ với nhà sản xuất sửa chữa.

V. Các vấn đề thường gặp và giải quyết

1. Độ đồng đều nhiệt độ không đáp ứng yêu cầu

Nguyên nhân: ô nhiễm khối homogenic (chẳng hạn như các sản phẩm PCR còn sót lại), cảm biến nhiệt độ lão hóa;

Giải pháp: Làm sạch các khối homogenized (lau bằng ethanol khan), thay thế cảm biến nhiệt độ.

2. cường độ tín hiệu huỳnh quang thấp

Lý do: hiệu chuẩn ROI không thành công (bản đồ vị trí lỗ sai), huỳnh quang nền quá cao;

Giải pháp: Thực hiện lại hiệu chuẩn ROI, chạy hiệu chuẩn nền (thay thế bảng hiệu chuẩn nền).

B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)

Lý do: biến động nhiệt độ quá mức (chẳng hạn như khối sưởi ấm không ổn định), giảm độ nhạy của máy dò huỳnh quang;

Giải pháp: Kiểm tra sự ổn định nhiệt độ của khối sưởi ấm (được đo bằng máy kiểm tra nhiệt độ đa kênh), thay thế máy dò huỳnh quang.

VI. Kết luận

Hiệu chỉnh máy đo PCR định lượng huỳnh quang là bước quan trọng để đảm bảo dữ liệu thí nghiệm chính xác và đáng tin cậy, đòi hỏi phải tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn công nghiệp (ví dụ: JJF1527-2015, JJF (JIN) 04-2020), thường xuyên hiệu chỉnh hệ thống điều khiển nhiệt độ và hệ thống quang học. Trong quá trình hiệu chuẩn cần chú ý đến điều kiện môi trường, hỗ trợ chuyên nghiệp và xác minh kết quả để đảm bảo hiệu suất của thiết bị phù hợp với yêu cầu thí nghiệm. Thông qua quy trình chỉnh sửa đặc điểm kỹ thuật, có thể giảm hiệu quả lỗi thử nghiệm, cải thiện độ chính xác và tính lặp lại của kết quả qPCR.