Kính hiển vi huỳnh quang Olympus

2018/7/26 7:52:45 Đăng bởi: admin

Với các tính năng khác dựa trên mẫu macroKính hiển vi quang họcSo sánh các chế độ, chẳng hạn như gradient pha, hấp thụ ánh sáng và khúc xạ kép, kính hiển vi huỳnh quang có thể hình ảnh sự phân bố của các loại phân tử riêng lẻ chỉ dựa trên các đặc tính của phát xạ huỳnh quang. Do đó, sử dụng kính hiển vi huỳnh quang, vị trí chính xác của các thành phần nội bào được đánh dấu bằng các cụm huỳnh quang cụ thể có thể được theo dõi, cũng như hệ số khuếch tán liên quan đến chúng, đặc điểm vận chuyển và các yếu tố khác.Sinh họcSự tương tác của các phân tử Ngoài ra, phản ứng đáng kể của huỳnh quang đối với các biến môi trường cục bộ cho phép nghiên cứu độ pH, độ nhớt, chỉ số khúc xạ, nồng độ ion, điện thế màng và phân cực dung môi trong các tế bào và mô sống.

Thiết bị vớt váng dầu mỡ cho xử lý nước thải -PetroXtractor - Well Oil Skimmer (Ánh sáng truyền qua）Hệ thống quang họcTập trung ánh sáng kích thích qua bộ lọc vào mặt phẳng mẫu. Phát xạ huỳnh quang được thu thập thông qua vật kính, cũng như một lượng lớn ánh sáng kích thích, và được chiếu vào ruột thừa thị kính thông qua bộ lọc thứ hai để tạo thành một hình ảnh trung gian. Bởi vì cường độ của ánh sáng kích thích thường lớn hơn nhiều so với phát xạ huỳnh quang, chế độ xem mẫu trong các kính hiển vi ánh sáng truyền qua sớm này thường có độ tương phản rất thấp và chồng lên nền đầy ánh sáng kích thích tán xạ. Chiếu sáng mẫu ở góc phương vị nghiêng cao bằng cách sử dụng một điểm tập trung trường tối ngâm dầu khẩu độ cao giúp loại bỏ hầu hết tiếng ồn nền, nhưng không cung cấp đủ ánh sáng ngoại trừ đối tượng khẩu độ thấp. Hình ảnh được tạo ra có độ phân giải kém và độ sáng rất thấp.

Máy chiếu Optoma (Ánh sáng phản chiếuÁnh sáng ban đầu được phát triển vào cuối những năm 1920 để quan sát sự phát xạ huỳnh quang trong các mẫu luyện kim mờ đục. Giống như các đối tác trường sáng của chúng, các dụng cụ huỳnh quang phản xạ này sử dụng bộ tách chùm bán phản xạ với tổng hiệu suất khoảng 25% (mất 50% độ sáng sau mỗi lần đi qua gương). Tuy nhiên, kính hiển vi huỳnh quang phản xạ có lợi thế là một đối tượng khẩu độ số cao hoạt động như một điểm tập trung và có khả năng tạo ra mức độ hình ảnh cao hơn đáng kể so với kính hiển vi ánh sáng truyền qua hoạt động ở khẩu độ số tương tự. Ngoài ra, ánh sáng kích thích đi lạc phản xạ trở lại đối tượng (ở khẩu độ số cao) giảm xuống chỉ còn vài phần trăm. Vai trò kép của vật kính trong kính hiển vi ánh sáng phản xạ cũng đơn giản hóa đáng kể nhiệm vụ căn chỉnh. Chỉ tập trung mục tiêu vào mẫu thiết lập trường chiếu sáng và trường nhìn sao cho ánh sáng kích thích tới và phát xạ huỳnh quang quan sát được đi theo cùng một con đường thông qua loạt quang học kính hiển vi.

Khi hơi thủy ngân nhỏ gọn và đèn phóng điện hồ quang xenon được phát triển vào giữa những năm 1930, những tiến bộ công nghệ trong các nguồn ánh sáng chiếu sáng đã thúc đẩy sự chuyển đổi của huỳnh quang ánh sáng phản xạ (ít nhất là đối với kim loại học). Các bộ lọc thủy tinh màu và gelatin cũng trở nên phức tạp hơn trong thời gian này, cho phép sử dụng đèn halogen vonfram để áp dụng thuốc nhuộm huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng nhìn thấy màu xanh lam và xanh lá cây. Lớp phủ chống phản xạ và công thức thủy tinh được cải tiến đã dẫn đến những cải tiến đáng kể trong thiết kế vật kính vào những năm 1940, nhưng đóng góp cơ bản cho sự phát triển của kính hiển vi huỳnh quang ánh sáng tới là sự ra đời của kính quang phổ lưỡng sắc (còn được gọi là gương nhị sắc), bắt đầu vào năm 1948 bởi nhà khoa học quang học người Nga Eugene Brumberg. Sự đổi mới này khắc phục vấn đề mất ánh sáng vốn có trong việc sử dụng gương bán phản xạ thông thường trong kính hiển vi ánh sáng phản xạ. Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ lần đầu tiên được thương mại hóa rộng rãi vào cuối những năm 1960 bởi Johan S. Ploem, người đã đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển Wild-Leitz Ploem Opak, chứa một số mô-đun quang học có thể hoán đổi cho nhau và được trang bị nhiều bộ lọc kính hiển vi huỳnh quang kết hợp.

Chiến lược cơ bản cho kính hiển vi huỳnh quang thả

Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ phần lớn là phương pháp lựa chọn hiện tại cho nghiên cứu trường rộng cho các nguồn ánh sáng không kết hợp, cũng như những phương pháp được thực hiện bằng các thiết bị quét laser đồng tập trung và đa photon. Chế độ kính hiển vi huỳnh quang phổ biến này còn được gọi là huỳnh quang ánh sáng tới, phản xạ huỳnh quang hoặc đơn giản là huỳnh quang thả. Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ hiện đại điển hình, cũng được trang bị các quan sát ánh sáng truyền qua ở các chế độ tăng cường độ tương phản khác nhau, như thể hiện trong Hình 1. Kính hiển vi chứa một đầu quan sát ba mắt kết hợp với hệ thống camera Charge Coupled Device (CCD)) với hai nguồn ánh sáng, một để truyền ánh sáng và một để quan sát (tương ứng với phóng điện hồ quang vonfram-halogen và thủy ngân). Kính hiển vi được thiết kế này có thể kết hợp hoặc luân phiên phản xạ huỳnh quang ánh sáng với độ tương phản pha ánh sáng truyền qua, độ tương phản giao thoa vi phân (DIC), quan sát độ tương phản phân cực hoặc điều chế Hoffmann.

Đặc điểm cơ bản của bất kỳ kính hiển vi huỳnh quang nào là cung cấp một cơ chế để kích thích mẫu với ánh sáng được lọc chọn lọc, sau đó sử dụng một bộ lọc thứ hai để tách phát xạ huỳnh quang yếu hơn để tạo thành hình ảnh với độ nhạy lớn trên nền tối. Trong nhiều thí nghiệm, nồng độ đầu dò cục bộ trong các mẫu sinh học rất thấp, chỉ một phần nhỏ ánh sáng kích thích được hấp thụ bởi chất huỳnh quang. Ngoài ra, tỷ lệ phát huỳnh quang thứ cấp thậm chí còn thấp hơn ở những đám có thể hấp thụ một lượng ánh sáng nhất định. Mức độ sáng phát xạ huỳnh quang thu được sẽ thấp hơn ba đến sáu bậc độ lớn so với mức độ sáng của ánh sáng. Do đó, vấn đề cơ bản với kính hiển vi huỳnh quang là tạo ra ánh sáng hiệu quả cao của mẫu trong khi chụp phát xạ huỳnh quang yếu, tách biệt hiệu quả với các dải chiếu sáng mạnh hơn. Các điều kiện này được đáp ứng trong các thiết bị huỳnh quang hiện đại thông qua sự kết hợp của các bộ lọc phối hợp các yêu cầu kích thích và phát xạ dựa trên vai trò và đặc điểm của bộ tách chùm hai màu.

Hình 2 phác thảo các nguyên tắc đằng sau chức năng của bộ tách chùm hai màu (gương) trong kính hiển vi huỳnh quang phản chiếu ánh sáng, chứa các mẫu giả định của một cụm huỳnh quang kích thích và phát ra huỳnh quang màu đỏ (620 đến 660 nanomet) bước sóng trong một vùng màu xanh lá cây (550 nanomet). Quang phổ có thể nhìn thấy. Các nguồn sáng cường độ cao tạo ra một dải rộng các bước sóng kích thích ở mật độ thông lượng cao (thường bao phủ hầu hết các tia cực tím và toàn bộ phổ nhìn thấy) đi qua đèn chiếu sáng và gặp bộ lọc đầu tiên chọn dải kích thích thích hợp (được đánh dấu EF; xem Hình 2 (a)). Trong trường hợp này, bộ lọc đi qua ánh sáng có bước sóng từ 510 đến 560 nanomet với hiệu quả cao, nhưng cũng cho phép các bước sóng khác đi qua với mức độ nhỏ hơn. Ánh sáng kích thích tiếp tục đến gương nhị sắc (DM trong Hình 2) và được phản xạ vào lỗ phía sau của vật kính để tạo thành ánh sáng hình nón của mẫu được chiếu sáng. Gương hai màu nằm trong đường dẫn ánh sáng ở góc 45 độ và được thiết kế để phản xạ có chọn lọc bước sóng giữa 490 và 565 nanomet (như trong Hình 3) trong khi truyền các bước sóng ngắn hơn và dài hơn.

Đường cong truyền được sử dụng để kết hợp ánh sáng kích thích với bộ lọc tách biệt với phát xạ huỳnh quang trong Hình 2 được thể hiện trong Hình 3. Phổ bộ lọc kích thích (đường cong màu đỏ) cho thấy mức độ truyền cao (khoảng 80%) giữa 510 và 560 nanomet. Bước sóng trung tâm (CWL) 535 nanomet. Gương nhị sắc (đường cong màu vàng) phản xạ kích thích bước sóng trong vùng phổ trong khi đi qua các bước sóng cao hơn và thấp hơn với hiệu quả tương đối cao. Lưu ý rằng tỷ lệ truyền phần trăm trên đường cong phản chiếu nhị sắc tương ứng với phản xạ 100%. Sự suy giảm đáng kể trong phân bố truyền qua giữa 490 và 570 nanomet (biểu thị đỉnh của độ phản xạ) được sử dụng để phản xạ các dải bước sóng đi vào mẫu ở góc 90 độ từ bộ lọc kích thích. Thành phần thứ hai trong loạt quang học, bộ lọc phát xạ hoặc rào cản (đường cong màu trắng), truyền các bước sóng trên 590 nanomet, tương ứng với ánh sáng nhìn thấy có màu vàng, cam và đỏ. Ranh giới giữa các dải truyền và phản xạ của các phổ chồng chéo khác nhau được thiết kế để càng dốc càng tốt để đảm bảo rằng các bước sóng phản xạ và truyền gần như * tách biệt. Các mô hình trong đó các gai hình sin tăng và giảm xuất hiện trong phổ gương nhị sắc là một hiệu ứng phổ biến của quá trình lắng đọng màng mỏng, được gọi là rung không ngừng. Hiệu suất của sự kết hợp bộ lọc này là tuyệt vời và minh chứng rõ ràng cho sự phát triển nhanh chóng của công nghệ bộ lọc giao thoa màng mỏng.

Bởi vì chỉ có ánh sáng băng thông hẹp được phản xạ bằng gương hai màu, bước sóng chiếu xạ ngắn hơn 490 nanomet và dài hơn 565 nanomet của bộ lọc kích thích cũng được truyền qua gương hai màu, như thể hiện trong ánh sáng phía trên cắt. Trong hình 2 (a). Lưu ý rằng phản xạ ánh sáng kích thích không hiệu quả 100%, do đó, một lượng nhỏ ánh sáng màu xanh lá cây đi qua gương nhị sắc mà không bị phản xạ. Ngoài ra, không phải tất cả ánh sáng có bước sóng lớn hơn 565 hoặc nhỏ hơn 490 nanomet đều đi qua gương. Một phần nhỏ của ánh sáng này được phản chiếu qua gương đối tượng vào mẫu.

Phát xạ huỳnh quang (chủ yếu là bước sóng màu đỏ) của mẫu được tạo ra bởi sự kích thích ánh sáng xanh lá cây được tập hợp bởi vật kính và đi qua bộ lọc nhị sắc và rào cản (trên ánh sáng bị cắt trong Hình 2 (c). Bộ lọc rào cản (được đánh dấu là BF trong Hình 2, được thiết kế đặc biệt để chỉ cho phép ánh sáng có bước sóng lớn hơn 590 nanomet tiếp cận thị kính hiển vi và/hoặc máy dò. Khi được sử dụng cho nhiệm vụ này, bộ lọc rào cản ngăn chặn hiệu quả các bước sóng ánh sáng kích thích phản xạ từ mẫu (và đã vượt qua thành công gương nhị sắc) đến máy dò. Tuy nhiên, hầu hết các bước sóng kích thích trở lại từ mẫu được phản xạ vào bộ lọc kích thích và bộ phát sáng bằng kính nhị sắc (ánh sáng dưới ánh sáng cắt trong Hình 2 (c). Hiệu ứng ròng của cấu hình bộ lọc được thể hiện trong Hình 2 và 3 là tách ánh sáng kích thích mạnh hơn đáng kể khỏi phát xạ huỳnh quang yếu hơn. Trong tất cả các trường hợp, như được hiển thị trong hình, mức cắt của các bộ lọc liên quan đến kính hiển vi huỳnh quang không phải là, nhưng có thể cho phép một số ánh sáng bên ngoài phạm vi bước sóng thâm nhập. Toàn bộ chuỗi sự kiện được trình bày bằng đồ họa trong Hình 2 (b), minh họa đường dẫn quang học và bố trí bộ lọc chiến lược cần thiết để phản xạ hiệu quả kính hiển vi huỳnh quang ánh sáng.

Đèn huỳnh quang dọc

Cốt lõi của kính hiển vi huỳnh quang hiện đại là đèn chiếu sáng thẳng đứng phản xạ phổ quát, nó cắm vào ống quan sát và mang theo vật kính.Mục tiêuGiữa các bộ chuyển đổi, như thể hiện trong hình 1 và 4. Đèn chiếu sáng được thiết kế để hướng ánh sáng được tạo ra bởi các điểm nổi bật - đặt nguồn cường độ trên mẫu đầu tiên bằng cách đưa ánh sáng qua vật kính hiển vi hướng về phía mẫu và sau đó sử dụng cùng một vật kính để chụp ánh sáng phát ra từ mẫu. Loại chiến lược chiếu sáng này có một số lợi thế. Vật kính hiển vi đầu tiên hoạt động như một điểm tập trung được điều chỉnh tốt, sau đó thu thập phát xạ huỳnh quang hình ảnh để truyền đến thị kính hoặc hệ thống phát hiện máy ảnh. Do đó, mục tiêu luôn được căn chỉnh chính xác liên quan đến từng chức năng. Ngoài ra, hầu hết ánh sáng kích thích (ở góc 360 độ) được tán xạ hoặc phản xạ bởi mẫu được đặt cách xa các yếu tố thấu kính phía trước của vật kính thay vì chiếu trực tiếp vào kính, chẳng hạn như trong trường hợp truyền huỳnh quang. Hiệu ứng này được gọi là chiếu sáng phía trước và đặc biệt thích hợp cho các mẫu vật dày. Sau đó, khu vực mẫu vật được chiếu xạ được giới hạn trong cùng một khu vực được quan sát và cả bộ sưu tập ánh sáng và ánh sáng đều có thể sử dụng khẩu độ đầy đủ của vật kính.

Ở đầu xa của đèn chiếu sáng thẳng đứng là hộp đèn (xem Hình 4), chứa xả hồ quang cường độ cao hoặc nguồn sáng sợi đốt dựa trên dây tóc. Nguồn ánh sáng phổ biến là đèn hồ quang thủy ngân 100 watt áp suất cao (HBO, thường được gọi là đầu đốt) Tuy nhiên, đèn hồ quang xenon và kim loại halogen, laser và đèn sợi đốt halogen vonfram cũng có thể được sử dụng cho mục đích này. Ánh sáng phát ra từ nguồn sáng được tập trung bởi hệ thống thấu kính tập trung và đi dọc theo bên trong đèn chiếu sáng song song với mặt bàn và vuông góc với trục quang của kính hiển vi. Thiết kế Luminator thể hiện trong Hình 4 bao gồm một hệ thống ống kính thu gom đa thành phần, nhưng các yếu tố ống kính phi cầu cũng được thực hiện để cải thiện hiệu chỉnh chênh lệch màu trong vùng cận hồng ngoại và cực tím. Bộ lọc nhiệt được thiết kế để loại bỏ hoặc ức chế bước sóng hồng ngoại được đặt bên trong hộp đèn hoặc phía sau đèn chiếu sáng dọc liền kề. Ngoài ra, một số kính hiển vi chứa các hệ thống gần hộp đèn cân bằng kích thích tần số kép hoặc đa tần số (xem Hình 4 và 8) lọc chọn lọc các bước sóng không mong muốn của kích thích để tinh chỉnh hiệu suất của bộ lọc huỳnh quang chứa ở đầu kia của đèn chiếu sáng.

Cũng nằm gần hộp đèn trong đèn chiếu sáng thẳng đứng là một bộ lọc mật độ trung tính có thể được sử dụng để điều chỉnh cường độ tổng thể của ánh sáng đi qua hệ thống và giảm sự phai màu huỳnh quang hoặc tẩy trắng ánh sáng. Các bộ lọc này thường được gắn trên khung trượt, cho phép chúng nhanh chóng chèn và loại bỏ các đường dẫn ánh sáng trong khi quan sát huỳnh quang của mẫu. Để thiết lập hệ thống chiếu sáng Köhler, đèn chiếu sáng dọc bao gồm một sự kết hợp khẩu độ trung tâm và khẩu độ trường nhìn, cả hai đều có khẩu độ thay đổi, xác định kích thước của trường và cường độ chiếu sáng. Điều chỉnh kích thước khẩu độ và khẩu độ trường cũng như điều chỉnh kích thước khẩu độ đạt được thông qua một số cặp núm nằm trên mỗi bên ngoài của vỏ đèn chiếu sáng thẳng đứng. Trong một số thiết kế, một núm trượt được cung cấp để loại bỏ toàn bộ cụm khẩu độ khỏi đường dẫn ánh sáng để tăng lượng ánh sáng đi qua đèn chiếu sáng. Các kính hiển vi khác chứa các lỗ kim có kích thước cố định được gắn trên một thanh trượt có thể được chèn vào đường dẫn ánh sáng, hạn chế đáng kể trường chiếu sáng và phù hợp cho các ứng dụng đặc biệt như khảo sát Phục hồi huỳnh quang (FRAP) sau khi tẩy trắng ánh sáng.

Tiếp theo là ống kính trường trong dòng quang học chiếu sáng thẳng đứng, cần thiết để khuếch tán ánh sáng và tạo ra đủ trường chiếu sáng để thiết lập ánh sáng Kohler. Sau kính hiện trường, tất cả các đèn chiếu sáng dọc hiện đại đều chứa một khóa (với điều khiển chuyển đổi thủ công) ngăn ánh sáng kích thích mạnh mẽ đến bộ lọc và mẫu khi không có huỳnh quang được quan sát hoặc ghi lại. Màn trập là một tính năng quan trọng của kính hiển vi huỳnh quang vì tiếp xúc liên tục với mẫu có thể làm giảm đáng kể phát xạ do tẩy trắng ánh sáng, không lành mạnh cho các tế bào sống. Ngoài ra, màn trập giữ cho đèn phóng hồ quang hoạt động (giảm thời gian khởi động) trong khi kiểm tra mẫu vật ngay lập tức bằng ánh sáng truyền qua. Kính hiển vi huỳnh quang thường được trang bị màn trập điện tử để điều khiển ánh sáng từ xa nhanh chóng. Tấm chắn tia cực tím (tấm chắn hơi thở được đánh dấu trong Hình 4 được gắn ở mặt trước của vỏ đèn chiếu sáng để bảo vệ người vận hành khỏi vô tình rò rỉ bức xạ tia cực tím sóng ngắn nguy hiểm tiềm ẩn khi cửa trập mở. Tấm chắn hoạt động gấp đôi bằng cách bảo vệ mẫu vật khỏi khí thở ra trong khi quan sát.

Một số thiết kế chiếu sáng dọc cung cấp khe cắm cho khung phân cực hình chữ nhật có thể được sử dụng trong nghiên cứu phân cực huỳnh quang. Trong hầu hết các trường hợp, bộ phân cực được lắp vào đường ánh sáng chiếu sáng phía sau gương trường (cách xa mặt phẳng liên hợp), nhưng trước khóa ánh sáng (xem Hình 4). Bộ phân cực có thể được cố định tại chỗ với phương vị truyền được xác định trước hoặc được gắn trên bộ bánh răng cho phép thay đổi hướng của trục truyền bằng cách sử dụng bánh răng. Vì bộ phân cực được gắn trong khung trượt, nó có thể dễ dàng được loại bỏ khỏi đường dẫn ánh sáng khi không sử dụng. Máy phân tích đi kèm (bộ phân cực thứ hai cần thiết cho phép đo đẳng hướng huỳnh quang) có thể được lắp đặt trong một bộ chiếu sáng thẳng đứng phía trên tháp lọc khối hoặc trong một ống giữa kính hiển vi phân cực được thiết kế đặc biệt. Các ống phụ thường có khả năng chèn các đơn vị phân cực quay của gradient để đảm bảo vị trí chính xác của phương vị truyền của bộ phân tích liên quan đến trục phân cực và kính hiển vi.

Giai đoạn sau của đèn chiếu sáng thẳng đứng chứa một tháp pháo quay hoặc giá đỡ trượt với một khối quang học chứa một sự kết hợp của bộ lọc huỳnh quang. Khi cần kết hợp hình ảnh với một bộ lọc huỳnh quang cụ thể, các khối lọc được xoay (hoặc trượt) vào dòng quang học. Một khối duy nhất chứa một tập hợp các bộ lọc kích thích và phát xạ phù hợp, cũng như các kính quang phổ hai màu, tất cả đều được định vị cẩn thận để tối đa hóa sự chiếu xạ của mẫu và chụp phát xạ huỳnh quang ở các bước sóng cụ thể. Tháp xoay khối quang học và giá đỡ trượt có thể được nạp từ ba đến sáu khối riêng biệt, một trong số đó nằm trong đường dẫn ánh sáng, trong khi các khối khác xoay hoặc trượt ra khỏi kho lưu trữ tạm thời. Khi quan sát một mẫu được đánh dấu bằng hai hoặc nhiều đầu dò huỳnh quang, các phụ kiện này có thể nhanh chóng chuyển đổi giữa các bộ lọc huỳnh quang. Việc sử dụng ánh sáng truyền qua trong kính hiển vi được trang bị đèn huỳnh quang được thúc đẩy bởi các khối quang học ảo được lắp ráp trong các khe trên bàn xoay hoặc giá đỡ trượt. Khối ảo ngăn chặn phát xạ kích thích (khi màn trập mở) nhưng không chứa bất kỳ bộ lọc nào và cho phép ánh sáng đi qua ống quan sát mà không bị cản trở từ vật kính.

Trong kính hiển vi thẳng đứng mô-đun tiêu chuẩn, đèn chiếu sáng dọc được đặtKính hiển viGiữa khung và ống quan sát (xem Hình 1). Nhiều nhà sản xuất cung cấp một ống trung gian có thể chèn vào giữa đèn chiếu sáng và các đơn vị thị kính để phân cực, lăng kính DIC hoặc các phụ kiện khác. Khung kính hiển vi hiện đại thường là kết quả của những nỗ lực thiết kế có sự hỗ trợ của máy tính, dẫn đến giảm rung đáng kể và tăng cường các tính năng công thái học. Các vật liệu tổng hợp, chẳng hạn như vật liệu composite gốm và nhôm dựa trên kim loại, có thể cải thiện đáng kể độ cứng tĩnh và nhiệt của khung, do đó cho phép thiết bị chịu được các yêu cầu khắt khe của công nghệ huỳnh quang tiên tiến đòi hỏi thời gian dài * loại bỏ rung động để hình ảnh phát xạ huỳnh quang yếu.

Kính hiển vi huỳnh quang Köhler

Trong đèn huỳnh quang dọc, nguồn sáng được định vị sao cho các sợi hoặc quả cầu plasma phóng điện hồ quang nằm gần tiêu điểm chính của ống kính tập trung. Trong ánh sáng Köhler, ống kính ánh sáng tập trung hoạt động như một nguồn ánh sáng phụ trợ tăng lên đáng kể để tăng cường ánh sáng tổng thể. Một trong những yêu cầu chính của ánh sáng Köhler là hình ảnh của dây tóc hoặc hồ quang cuối cùng phải được chiếu lên mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính, cũng gấp đôi (thường là khẩu độ số cao) của điểm tập trung trong quá trình kích thích ánh sáng phản chiếu. Lý tưởng nhất, nguồn sáng nên lấp đầy toàn bộ khẩu độ vật kính để khuếch đại cường độ bức xạ và tạo ra một trường chiếu xạ đồng đều. Trong một số trường hợp, điểm nóng Tuy nhiên, vì bộ lọc khuếch tán cũng làm giảm độ sáng, nên tránh sử dụng bất cứ khi nào có thể.

Trong ánh sáng phản chiếu Köhler (được thể hiện rõ ràng trong Hình 5), hình ảnh của nguồn sáng được tập trung bởi một thấu kính tập trung vào màng ngăn khẩu độ nằm trong đèn chiếu sáng thẳng đứng. Lan can này chia sẻ một mặt phẳng liên hợp với các lỗ phía sau của vật kính và vòng cung đèn hoặc dây tóc, do đó xác định kích thước khẩu độ trường chiếu xạ. Nguồn sáng, ống kính khẩu độ của đèn chiếu sáng thẳng đứng và mặt phẳng tiêu cự phía sau vật kính (đồng tử ánh sáng) cùng nhau tạo thành nhóm ánh sáng của mặt phẳng liên hợp. Không giống như trường hợp của kính hiển vi ánh sáng truyền qua, khẩu độ và nguồn sáng được hình ảnh trên mặt phẳng khẩu độ phía sau của vật kính (hoạt động như một điểm tập trung) thay vì nằm vật lý ở vị trí đó. Như một lợi ích bổ sung của cấu hình này, tất cả các chướng ngại vật, chẳng hạn như khẩu độ iris, được loại bỏ khỏi đường dẫn ánh sáng khi đối tượng cung cấp chiếu xạ kích thích hoặc hình thành hình ảnh bằng phát xạ huỳnh quang tích tụ. Mở hoặc đóng khẩu độ được sử dụng để kiểm soát nhiễu loạn và điều chỉnh cường độ của ánh sáng (khẩu độ số) mà không thay đổi kích thước của trường chiếu sáng. Trong hình ảnh, việc điều chỉnh khẩu độ ảnh hưởng đến độ sáng và độ tương phản.

Hình ảnh hoặc nhóm trường của mặt phẳng liên hợp trong ánh sáng Köhler phản chiếu bao gồm một quang phổ trường, bề mặt mẫu và mặt phẳng hình ảnh trung gian. Do đó, hình ảnh của nguồn sáng bị loại bỏ đáng kể khỏi tiêu điểm trong khi tập trung vào mặt phẳng mẫu để cung cấp một trường chiếu sáng đồng nhất. Quang cảnh trường kiểm soát kích thước của trường chiếu sáng mà không ảnh hưởng đến cường độ chiếu sáng của khu vực được quan sát. Trong thực tế, kích thước mở khẩu độ trường nên càng nhỏ càng tốt để tăng độ tương phản của hình ảnh và giảm mức độ tẩy trắng ánh sáng ở các khu vực không được quan sát trực tiếp. Mặc dù hầu hết các nguồn phóng hồ quang và ánh sáng dây tóc tạo ra cường độ ánh sáng không đồng đều, ánh sáng Köhler có thể chiếu sáng trường mẫu đồng đều. Khi kính hiển vi được cấu hình chính xác, mặt phẳng lấy nét phía sau * của vật kính được chiếu sáng, cung cấp một khu vực sáng đồng đều từ mép đến mép. Lý tưởng nhất, ánh sáng Köhler tắm mẫu với một tập hợp các mặt trước sóng hội tụ, mỗi được hình thành bởi các điểm riêng biệt trên nguồn sáng được hình ảnh vào khẩu độ của đèn. Trong kính hiển vi huỳnh quang được cấu hình chính xác, kết quả là độ tương phản và độ phân giải của hình ảnh. Lý tưởng nhất, mẫu được tắm bằng một tập hợp các mặt sóng hội tụ, mỗi mặt được tạo ra bởi một điểm khác nhau trên nguồn ánh sáng được chụp ảnh với khẩu độ của bộ thu. Trong kính hiển vi huỳnh quang được cấu hình chính xác, kết quả là độ tương phản và độ phân giải của hình ảnh. Lý tưởng nhất, các mẫu được tắm bằng cách sử dụng một tập hợp các mặt trước sóng hội tụ, mỗi mặt được tạo thành từ hình ảnh.Gương tập trungCác điểm khác nhau được tạo ra trên các nguồn ánh sáng có đường độ. Trong kính hiển vi huỳnh quang được cấu hình chính xác, kết quả là độ tương phản và độ phân giải của hình ảnh.

Nguồn sáng và ngọn hải đăng

Đối với phân tích định lượng nghiêm ngặt trong kính hiển vi huỳnh quang, chiếu xạ mẫu phải không đổi về thời gian và không gian trong suốt trường nhìn. Sự bất ổn theo thời gian thường phản ánh sự biến động của bức xạ đèn xảy ra do sự thay đổi trong sản lượng điện. Thay vào đó, sự xáo trộn không gian thường xảy ra trong đèn hồ quang đến từ một hiện tượng gọi là nhấp nháy vì quả cầu plasma di chuyển qua lại trên các điện cực. Nhấp nháy thường được tạo ra bởi dao động nguồn điện, thay đổi nhỏ trong điện trở điện cực hoặc rung động cơ học. Các nguồn sáng dựa trên dây tóc, chẳng hạn như đèn vonfram halogen phổ biến, rất ổn định khi hoạt động dưới dòng điện DC liên tục sử dụng nguồn điện ổn định. Thông thường, nguồn sáng nên được chọn từ nội dung phổ của nó, kích thước dây tóc so với khu vực khẩu độ phía sau vật kính, sự ổn định không gian và thời gian và tính đồng nhất của ánh sáng trường. Cũng cần đặc biệt chú ý đến cường độ của nguồn sáng, vì bước sóng băng hẹp mà bộ lọc kích thích đi qua chỉ bao gồm một phần rất nhỏ của tổng sản lượng phát sáng.

Những cân nhắc chính trong việc lựa chọn nguồn ánh sáng được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang là kết hợp với nghiên cứuThuốc nhuộm huỳnh quangNăng suất lượng tử và sự hấp thụ liên quan đến sự phân bố quang phổ tử ngoại và nhìn thấy được. Ngoài ra, nguồn sáng phải tương thích với độ nhạy của máy dò được sử dụng để chụp ảnh, cho dù đó là mắt người, phim truyền thống, ống nhân quang, ống video nâng cao hoặc hệ thống máy ảnh kỹ thuật số. Sự lựa chọn cũng phụ thuộc vào chế độ chiếu sáng. Các yêu cầu về kính hiển vi huỳnh quang trường rộng được đáp ứng bằng cách sử dụng phóng điện hồ quang hoặc nguồn vonfram-halogen, trong khi kính hiển vi đồng tập trung và đa photon cần được điều chỉnh cho các hệ thống laser khác nhau. Việc sử dụng đèn sợi đốt vonfram và vonfram halogen đã đạt được thành công hạn chế vì phần lớn phát xạ của chúng xảy ra ở các vùng đỏ và hồng ngoại của quang phổ, trong khi hầu hết các đám huỳnh quang bị kích thích bởi các bước sóng cực tím, xanh dương và xanh lá cây. Ngoài ra, sản lượng ánh sáng của đèn phóng điện hồ quang sáng hơn 10 đến 100 lần so với đèn halogen thạch anh 12 volt thường được sử dụng để truyền ánh sáng. Nguồn sáng phổ biến cho kính hiển vi huỳnh quang trường rộng là đèn hồ quang thủy ngân, thường được bao gồm trong cấu hình kính hiển vi mô hình cơ bản. Trong một số trường hợp, đèn hồ quang xenon và halogen kim loại được sử dụng, nhưng chúng thường bị giới hạn trong các trường hợp đặc biệt khi phổ và phân bố cường độ phù hợp với các yêu cầu về khối huỳnh quang cụ thể.

Đèn thủy ngân và xenon được thiết kế tương tự, ngoại trừ kích thước vật lý và khí trong vỏ bóng đèn. Đèn thủy ngân chứa hai điện cực được niêm phong trong một bóng đèn thủy tinh thạch anh ở áp suất cao, cũng chứa thủy ngân nguyên tố bốc hơi. Khi nguồn điện được cấp điện, một loạt các xung điện áp cao được gửi đến các điện cực ion hóa một phần nhỏ khí thủy ngân và thắp sáng đèn. Sau khi nung, điện áp giảm và khí ion hóa được sử dụng để mang dòng điện và tạo ra một quả bóng plasma hình thành giữa hai điện cực. Trong quá trình làm việc của đèn, sự bay hơi của thủy ngân tạo ra một lượng lớn nhiệt và áp suất bên trong bóng đèn thủy tinh, kết thúc với cường độ ánh sáng cao. Đèn hồ quang thủy ngân tạo ra ánh sáng liên tục ngay cả trong các dải phổ UV và nhìn thấy, tập trung ở các bước sóng rời rạc 365,400,440,546 và 580 nanomet. Từ tia cực tím đến hồng ngoại, đèn xenon có sự phân bố cường độ đồng đều hơn trên toàn phổ. Việc lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang là rất quan trọng để xác định nguồn sáng thích hợp cho kính hiển vi huỳnh quang. Một số đầu dò huỳnh quang có dải kích thích trùng với các dây thủy ngân nổi bật, trong khi những đầu dò khác được hưởng lợi từ sự chiếu xạ phân bố đều hơn của đèn xenon.

Sự liên kết chính xác của đèn hồ quang trong kính hiển vi huỳnh quang là rất quan trọng để đạt được ánh sáng Kohler và tránh các khu vực sáng và tối trong hình ảnh huỳnh quang. Do đó, chất lượng của hộp đèn thường có thể được đánh giá bằng sự ổn định của căn chỉnh đèn chính xác và hiệu quả của núm điều chỉnh được sử dụng để duy trì căn chỉnh. Đế đèn nên được trang bị vít giữa đèn để làm cho hình ảnh cong trung tâm trong lỗ sau của vật kính và hộp đèn nên chứa bộ lọc hồng ngoại để chặn bước sóng dài trong màu đỏ xa và hồng ngoại, tạo ra rất nhiều nhiệt. Một số hộp đèn được thiết kế với bộ lọc ức chế màu đỏ tích hợp (ví dụ: Schott BG38) hoặc khe cắm cho bộ lọc này để loại bỏ nền màu đỏ có thể nhìn thấy qua trường nhìn trong một số ứng dụng. Ngoài ra, bản thân hộp đèn không nên rò rỉ các bước sóng UV có hại và tốt nhất là bao gồm các công tắc để tự động tắt đèn nếu vỏ được bật vô tình trong quá trình hoạt động. Sau đó, hộp đèn phải đủ mạnh để chịu được các vụ nổ đầu đốt có thể xảy ra trong quá trình hoạt động.

Sự đa dạng rộng rãi của các ứng dụng kính hiển vi huỳnh quang thường đòi hỏi một loạt các nguồn sáng để đáp ứng các yêu cầu của các cụm huỳnh quang và điều kiện hình ảnh cụ thể. Trong một số trường hợp, kết hợp với một hệ thống camera siêu nhạy có thể yêu cầu bức xạ rất thấp, trong khi đối với các nghiên cứu khác, kích thích laser mạnh có thể được yêu cầu để tiêu diệt các tế bào sống hoặc tẩy trắng có chọn lọc huỳnh quang. Các yêu cầu về bước sóng thường kéo dài toàn bộ khu vực có thể nhìn thấy của quang phổ, cũng như các phần của tia cực tím và hồng ngoại. Vì một nguồn sáng duy nhất không thể đáp ứng nhiều yêu cầu chiếu sáng này, các nhà sản xuất hiện đang cung cấp bộ chuyển đổi có thể kết nối hai hoặc nhiều đèn với một kính hiển vi duy nhất cùng một lúc.

Bộ lọc huỳnh quang kết hợp

Như đã đề cập trước đó, ánh sáng đi qua ống kính và ruột thừa của đèn chiếu sáng thẳng đứng cuối cùng gặp phải bộ lọc kích thích được chứa trong một khối quang học được định vị trùng với giao điểm trục giữa đường ánh sáng của đèn chiếu sáng và hệ thống quang học kính hiển vi. Bộ lọc kích thích chọn một bước sóng băng hẹp từ phổ rộng do đèn tạo ra và truyền chúng đến gương nhị sắc, lần lượt phản chiếu ánh sáng qua đối tượng và chiếu sáng vào mẫu. Trước khi hình ảnh được hình thành trong ruột thừa thị kính cố định, sự phát xạ huỳnh quang được thu thập bởi vật kính một lần nữa đi qua ống nhị sắc và bộ lọc phát xạ hoặc rào cản. Các bộ lọc phổ biến được sử dụng để tách các dải trong kính hiển vi huỳnh quang trường rộng bao gồm bộ lọc kính màu và bộ lọc màng giao thoa (hoặc kết hợp cả hai). Việc xác định bộ lọc phù hợp cho từng bước trong sơ đồ chiếu sáng và hình ảnh của kính hiển vi huỳnh quang có thể gây nhầm lẫn vì một số lượng lớn các nhà sản xuất bộ lọc liên quan, mỗi nhà cung cấp danh pháp chữ và số độc quyền cho văn học huỳnh quang.

Biểu đồ 7 cho thấy điển hình.Khối kích thích huỳnh quangKết cấu giải phẫu, và kính hai màu, kích thích và các đường nét quang phổ liên quan đến bộ lọc rào chắn. Các khối lọc thường được lắp ráp bằng các công cụ tùy chỉnh do nhà sản xuất cung cấp để người vận hành có thể hoán đổi bộ lọc và gương hai màu cho nhau. Bộ lọc kích thích và rào cản được cố định tại chỗ bằng kẹp cố định, keo quang học hoặc ghế gắn ren tròn (xem Hình 7). Thông thường, các bộ lọc này có thể được loại bỏ mà không cần mở các khối quang học vì chúng nằm trên các lỗ lõm trên bề mặt bên ngoài bằng phẳng. Thay thế gương hai màu là khó khăn hơn và yêu cầu * loại bỏ các khối để đi vào bên trong. Hầu hết các phần khối được đúc bằng khớp nối chéo 45 độ cho phép thực hiện nhiệm vụ kép bằng cách bảo vệ bên trong và hỗ trợ gương nhị sắc ở góc thích hợp. Sau khi loại bỏ các ốc vít (chốt hoặc ốc vít nhỏ) giữ các phần của khối với nhau, gương có thể được gỡ bỏ bằng cách nới lỏng hoặc di chuyển kẹp giữ và sau đó cẩn thận lấy nó ra khỏi khối. Gương hai màu nên được xử lý cẩn thận vì lớp phủ can thiệp thường không được bảo vệ và dễ bị trầy xước. Một số nhà sản xuất bộ lọc cung cấp các công ty kính hiển vi cũng cung cấp một loạt các bộ lọc hậu mãi và gương hai màu cho các ứng dụng huỳnh quang khác nhau. Sau khi loại bỏ các ốc vít (chốt hoặc ốc vít nhỏ) giữ các phần của khối với nhau, gương có thể được gỡ bỏ bằng cách nới lỏng hoặc di chuyển kẹp giữ và sau đó cẩn thận lấy nó ra khỏi khối. Gương hai màu nên được xử lý cẩn thận vì lớp phủ can thiệp thường không được bảo vệ và dễ bị trầy xước. Một số nhà sản xuất bộ lọc cung cấp các công ty kính hiển vi cũng cung cấp một loạt các bộ lọc hậu mãi và gương hai màu cho các ứng dụng huỳnh quang khác nhau. Sau khi loại bỏ các ốc vít (chốt hoặc ốc vít nhỏ) giữ các phần của khối với nhau, gương có thể được gỡ bỏ bằng cách nới lỏng hoặc di chuyển kẹp giữ và sau đó cẩn thận lấy nó ra khỏi khối. Gương hai màu nên được xử lý cẩn thận vì lớp phủ can thiệp thường không được bảo vệ và dễ bị trầy xước. Một số nhà sản xuất bộ lọc cung cấp các công ty kính hiển vi cũng cung cấp một loạt các bộ lọc hậu mãi và gương hai màu cho các ứng dụng huỳnh quang khác nhau.

Thiết kế bộ lọc huỳnh quang bao gồm thông dài, thông ngắn (bộ lọc cạnh) và loạt bộ lọc băng thông hẹp, trung bình và băng thông rộng. Quang phổ được hiển thị trong Hình 7 cho thấy một số ví dụ về các đường viền bộ lọc phổ biến. Phổ bộ lọc phát xạ (đường cong màu xanh) trong Hình 7 được tạo ra bởi một bộ lọc giao thoa thông dài với bước sóng cắt khoảng 575 nanomet. Các bước sóng dài hơn được truyền qua bộ lọc, trong khi các bước sóng ngắn hơn bị chặn. Các bộ lọc kích thích băng thông hẹp (đường cong màu đỏ, Hình 7) từ cùng một nhóm có băng thông khoảng 20 nanomet, trong khi các bộ lọc nhị sắc (đường cong màu xanh lá cây) có vùng truyền gần trung bình (455-490 nanomet) và bộ lọc băng thông rộng (560) -775 nanomet). Bởi vì kính nhị sắc hoạt động hiệu quả như một bộ lọc dài trong màu xanh lá cây, các vùng màu vàng và đỏ của phổ nhìn thấy (560 đến 700 nanomet) được xử lý trong bộ lọc. Kiến thức làm việc về cách sử dụng sự hấp thụ và phân bố phổ phát xạ huỳnh quang để chọn bộ lọc kính hiển vi huỳnh quang phù hợp là * để thực hiện thành công công công nghệ này.

Một kính hai màu (hoặc kính tách chùm) là một thành phần quan trọng trong sự kết hợp của bộ lọc kính hiển vi huỳnh quang, tương tự như một bộ lọc loại giao thoa longpass, được sản xuất để có dung sai với nhiều lớp vật liệu điện môi. Sự khác biệt chính giữa gương nhị sắc và bộ lọc giao thoa tiêu chuẩn là gương được thiết kế đặc biệt để phản xạ và truyền ở các bước sóng ranh giới xác định và phải hoạt động ở góc 45 độ so với trục quang của kính hiển vi và bộ phát sáng. Định vị gương nhị sắc sao cho lớp phủ giao thoa hướng về nguồn sáng kích thích để các bước sóng kích thích ngắn được phản xạ qua hệ thống quang học ở góc 90 độ đến mẫu. Cùng một gương cũng phải hoạt động như một bộ lọc truyền để truyền phát huỳnh quang bước sóng dài từ vật kính đến mặt phẳng hình ảnh. Bởi vì các vùng chuyển tiếp bước sóng giữa phản xạ gần như đầy đủ và truyền lớn thường được giới hạn ở 20 hoặc 30 nanomet, gương nhị sắc có thể phân biệt chính xác các bước sóng kích thích và phát ra.

Thiết kế bộ lọc huỳnh quang sao cho các dải bước sóng kích thích cụ thể phù hợp chính xác với các vùng phản xạ trong gương hai màu. Kết quả là ánh sáng kích thích được phản xạ hiệu quả qua kính hiển vi vào mẫu. Phát xạ huỳnh quang của mẫu phải phù hợp với vùng truyền cao trong gương nhị sắc để cho phép các bước sóng này đi qua máy dò. Bộ lọc rào cản ít quan trọng hơn trong toàn bộ sơ đồ, nhưng vẫn đóng một vai trò quan trọng trong việc đảm bảo loại bỏ các bước sóng kích thích của tán xạ và phản xạ, huỳnh quang từ đầu dò khác với mục tiêu và cường độ nền chung do huỳnh quang tự phát. Yếu tố quan trọng để tạo ra bộ lọc là đảm bảo rằng đường truyền, phản xạ, đường cong phát xạ của bộ lọc liên quan phù hợp với đường cong phát xạ của khu vực tương ứng. Nếu không, bước sóng kích thích có thể đi qua gương nhị sắc và làm mờ hình ảnh, hoặc phát xạ huỳnh quang có thể vô tình phản xạ vào gương để làm giảm độ sáng của hình ảnh.

Ngay cả trong các kết hợp bộ lọc dường như phù hợp hoàn hảo, sự chồng chéo nhẹ giữa phân phối quang phổ của các bộ lọc riêng lẻ có thể xảy ra, làm giảm hiệu suất. Mối quan tâm đặc biệt là kích thích nhiễu xuyên âm giữa bộ lọc và gương hai màu, cho phép một số ánh sáng kích thích đi qua gương và phản xạ từ các bức tường của khối lọc. Như đã đề cập ở trên, ánh sáng phản xạ ở góc nghiêng cao có thể đi qua bộ lọc rào cản một phần để giảm độ tương phản của hình ảnh. Sự rò rỉ này thông qua các bộ lọc được gọi là thâm nhập hoặc chéo thực sự xảy ra nhiều hơn hoặc ít hơn tất cả các kết hợp bộ lọc. Một trong những lĩnh vực chính mà các nhà sản xuất bộ lọc và các công ty kính hiển vi quan tâm là cải thiện thiết kế kết hợp bộ lọc huỳnh quang để giảm mức chéo.

Một số cấu hình cho bộ lọc huỳnh quang được thể hiện trong Hình 8. Bộ lọc khối tháp pháo (Hình 8(a)) chứa năm khối có thể nhanh chóng chuyển đổi giữa các bộ lọc kết hợp trong khi nghiên cứu ít nhất số lượng này của các cụm huỳnh quang. Một trong những rãnh tháp pháo thường được lấp đầy với các khối quang học ảo hoặc để trống để quan sát ánh sáng truyền qua. Sử dụng bộ cân bằng kích thích (Hình 8 (b)) để tinh chỉnh quang phổ kích thích để hình ảnh mẫu được đánh dấu kép hoặc nhiều lần, chứa một bộ lọc giao thoa duy nhất được gắn trên khớp quay. Thanh điều chỉnh của bộ cân bằng kích thích xoay di chuyển vùng truyền băng qua của bộ lọc đến bước sóng ngắn hơn. Do đó, vùng băng thông của bộ lọc có thể di chuyển giá trị từ 25 đến 50 nanomet khi bộ lọc cân bằng được xoay từ góc tới 0 độ (vuông góc với trục chiếu sáng thẳng đứng) đến góc quay lớn 45 độ. Bộ cân bằng kích thích có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc nối tiếp để thay đổi băng thông kích thích của thuốc nhuộm huỳnh quang khi quan sát để tạo ra cường độ phát xạ bằng nhau. Tính năng này cho phép tinh chỉnh cường độ của đám huỳnh quang trong một mẫu có chứa một số đầu dò, ví dụ, giảm phát xạ huỳnh quang từ một đầu dò trong khi tăng cường độ của đầu dò khác. Bộ cân bằng kích thích có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc nối tiếp để thay đổi băng thông kích thích của thuốc nhuộm huỳnh quang khi quan sát để tạo ra cường độ phát xạ bằng nhau. Tính năng này cho phép tinh chỉnh cường độ của đám huỳnh quang trong một mẫu có chứa một số đầu dò, ví dụ, giảm phát xạ huỳnh quang từ một đầu dò trong khi tăng cường độ của đầu dò khác. Bộ cân bằng kích thích có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc nối tiếp để thay đổi băng thông kích thích của thuốc nhuộm huỳnh quang khi quan sát để tạo ra cường độ phát xạ bằng nhau. Tính năng này cho phép tinh chỉnh cường độ của đám huỳnh quang trong một mẫu có chứa một số đầu dò, ví dụ, giảm phát xạ huỳnh quang từ một đầu dò trong khi tăng cường độ của đầu dò khác.

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ phủ màng mỏng có thể được chứng minh bằng khả năng tạo ra nhiều đỉnh truyền trong một bộ lọc giao thoa duy nhất và tạo ra các dải phản xạ và truyền xen kẽ trong gương nhị sắc. Khi phù hợp, hai bộ lọc đa băng tần và kính nhị sắc có thể được kết hợp để tạo ra nhiều bộ lọc huỳnh quang có khả năng kích thích và quan sát sự phát xạ của một số cụm huỳnh quang cùng một lúc. Bộ lọc có sẵn từ nhà sản xuất và phù hợp với hai, ba hoặc thậm chí bốn cụm huỳnh quang trong cùng một mẫu. Vấn đề chính với nhiều bộ lọc là chi phí của chúng và sự vượt qua hoặc xâm nhập quá mức xảy ra khi phát xạ từ một đầu dò huỳnh quang đi qua khu vực băng thông được sử dụng cho bộ lọc khác. Trong một số mẫu (và bộ lọc), thẩm thấu có ảnh hưởng đáng kể đến cường độ nền và độ tương phản của hình ảnh. Nhiều nhà nghiên cứu có xu hướng sử dụng bộ lọc tối ưu để chụp ảnh từng cụm huỳnh quang riêng biệt, sau đó kết hợp hình ảnh thành phức hợp.

Công nghệ huỳnh quang tiên tiến thường đòi hỏi việc sử dụng nhiều bộ lọc kích thích và phát xạ với một kính hai màu duy nhất. Để tạo điều kiện cho các nghiên cứu này, nhiều kính hiển vi huỳnh quang được trang bị bánh xe lọc điện hoặc thanh trượt chứa nhiều hơn sáu bộ lọc riêng biệt (xem Hình 8 (c)). Kính hiển vi được thiết kế để sử dụng với các thanh trượt hoặc bao gồm các khe đặc biệt để chèn các thanh trượt trong đèn chiếu sáng dọc hoặc thanh trượt bộ lọc có thể thay thế các thanh trượt thường chứa các bộ lọc mật độ trung tính. Trong một số thiết kế kính hiển vi, đèn chiếu sáng dọc cũng có thể chứa một thanh trượt phát xạ hoặc một ống trung gian phụ được gắn giữa đèn chiếu sáng và ống quan sát để chứa thanh trượt. Trong kính hiển vi thẳng đứng và ngược, bộ lọc điện có chứa bộ lọc kích thích thường được kẹp trong con đường quang học của bộ chiếu sáng thẳng đứng giữa bộ lọc mật độ trung tính và hộp đèn. Tương tự như vậy, các đơn vị bộ lọc phát xạ điện được đặt giữa đèn chiếu sáng thẳng đứng và ống quan sát thị kính trong thiết kế kính hiển vi thẳng đứng, nhưng thường được kết nối thông qua cùng một cổng bên ngoài như các máy dò được sử dụng để đảo ngược thiết bị. Các thanh trượt kích thích và phát xạ và bánh xe lọc điện rất hữu ích cho các ứng dụng kích thích kép và ba sử dụng một gương hai màu duy nhất. Bằng cách loại bỏ sự cần thiết phải định vị lại các khối lọc khi quan sát các mẫu riêng lẻ, các tệp đính kèm này cho phép các nhà nghiên cứu có được đăng ký chính xác giữa các hình ảnh.

Vật kính hiển vi huỳnh quang

Trong tất cả các dạng kính hiển vi ánh sáng phản chiếu, bao gồm huỳnh quang, cường độ hình ảnh là một hàm của khẩu độ và độ phóng đại số của vật kính. Trong thực tế, cường độ hoặc độ sáng (được định nghĩa là thông lượng photon trên một đơn vị diện tích và thời gian) làm tăng khẩu độ số gấp bốn lần, nhưng chỉ tỷ lệ nghịch với bình phương độ phóng đại:

Sức mạnh α (NA obj) 4/M 2

Trong đó NA là khẩu độ số đối tượng và M. là độ phóng đại. Rõ ràng từ mối quan hệ này, hình ảnh huỳnh quang sáng sẽ được tạo ra bởi một người có độ caoKhẩu độ sốVà độ phóng đại thấp (ví dụ: 0,75/20x) tập hợp mục tiêu. Ví dụ, một mục tiêu ngâm dầu khử màu theo kế hoạch 60x với khẩu độ số 1,4 về mặt lý thuyết sẽ tạo ra một hình ảnh sáng hơn một mục tiêu 100 lần với cùng khẩu độ số, nhưng cần phải xem xét thỏa hiệp. Tăng số lượng các yếu tố thấu kính bên trong (như đối tượng khẩu độ cao) tạo ra sự gia tăng tương ứng giữa huỳnh quang tự phát và phản xạ giảm cường độ từ bề mặt thấu kính bên trong. Thông thường, các nhà sản xuất tạo ra sự thỏa hiệp giữa các yếu tố tích cực của trường đại học và sự truyền ánh sáng tăng lên trong kính hiển vi huỳnh quang được khuyến nghị của họ.

Nói chung, các loại dầu khẩu độ cao (1,3 đến 1,4) và nước (1,2) được ngâm trong fluorit theo kế hoạch và các mục tiêu khử màu phẳng tạo ra hình ảnh huỳnh quang sáng do khả năng tập trung lớn của chúng. Những vật kính này cho thấy hiệu chỉnh màu sắc tuyệt vời và do đó có thể tập trung nhiều bước sóng phát xạ huỳnh quang trong cùng một mặt phẳng. Các đặc tính truyền ánh sáng của vật kính khử màu và fluorit là * ở mức thấp khoảng 350 nanomet, đây là yêu cầu để kiểm tra thuốc nhuộm huỳnh quang kích thích trong vùng cực tím (ví dụ: DAPI, Hoechst, Alexa Fluor-350 và AMC). Mặc dù có nhiều ống kính bên trong, những vật kính này được làm từ kính huỳnh quang thấp với lớp phủ chống phản xạ để giảm thiểu huỳnh quang nền và tạo ra hình ảnh có độ tương phản rất cao.

Vật kính được thiết kế cho các ứng dụng đặc biệt được sử dụng rộng rãi trong kính hiển vi huỳnh quang. Lớp này bao gồm ngâm nước có khẩu độ cao, ngâm nhiều lần (dầu, nước và glycerin), và vật kính UV với các yếu tố thấu kính thạch anh. Đối với các ứng dụng hình ảnh tế bào sống, cần có vật kính tầm hoạt động dài với vòng điều chỉnh để quan sát mẫu qua thành chai nuôi cấy dày (0,5-2 mm). Tạo điều kiện kiểm tra độ sâu của mẫu vật dày bằng các vật kính có độ dài tiêu cự rất dài (khoảng cách làm việc), có thể thu được từ một số nhà sản xuất để chụp ảnh bằng kính bao phủ không khí hoặc nước. Các vật thể ngâm nước tầm xa hoạt động dài được thiết kế để sử dụng mà không có nắp trượt cũng có hình nón Teflon phía trước, vì vậy nó có thể ngâm vật thể vào dung dịch nước. Đối với kích thích tia cực tím (340 nanomet) trong nước ở khoảng cách hoạt động từ 20 đến 30 mm (bao gồm khoảng 5 mm nước) tạo ra vật kính tương tự. Đối với các nghiên cứu độ phóng đại tương đối thấp, nên sử dụng kính ngâm nước 20 lần với khẩu độ * số (0,75 đến 0,95). Mặc dù rất tốn kém, những vật kính này tạo ra hình ảnh cực kỳ sáng với nồng độ đám huỳnh quang và/hoặc năng suất lượng tử không đáng kể.

Phụ kiện kính hiển vi huỳnh quang

Các nhà sản xuất liên tục sản xuất các đơn vị phụ kiện bổ sung hữu ích cho các thiết bị của họ để tăng sự lựa chọn có sẵn cho các ứng dụng hình ảnh ngày càng tăng trong kính hiển vi huỳnh quang. Ví dụ, một trường hình chữ nhật có thể được chọn trên một số kính hiển vi (xem Hình 9), có thể hạn chế khu vực mẫu được chiếu xạ để tăng độ tương phản và giảm tẩy trắng ánh sáng. Thay vì khẩu độ truyền thống (cũng là mô-đun có thể tháo rời) trong đèn chiếu sáng dọc, khẩu độ trường mô-đun được thiết kế để phù hợp với tỷ lệ khung hình của cảm biến hình ảnh kỹ thuật số. Việc dừng trường hình chữ nhật làm tăng hiệu quả của ánh sáng Kohler và giảm tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn của cảm biến điện tử. Như một lợi ích bổ sung, kích thước hình chữ nhật hình ảnh có thể được điều chỉnh để phù hợp với các bước của giai đoạn khi sử dụng giai đoạn quét có thể lập trình trong nghiên cứu tích chập. Pinhole tương tự như một trường hình chữ nhật và có thể được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi một trường chiếu sáng hạn chế cao.

Các phụ kiện khác bao gồm bộ chuyển đổi vỏ đèn đôi cho phép kết nối đồng thời hai nguồn sáng, chẳng hạn như đèn phóng điện Quicksilver và Xenon Arc, với đèn chiếu sáng thẳng đứng. Đèn chiếu sáng thích hợp để kích thích laser cũng có thể được sử dụng trong các ứng dụng như huỳnh quang phản xạ toàn phần (TIRF), kính hiển vi hình ảnh tuổi thọ huỳnh quang (FLIM), hình ảnh tỷ lệ và thí nghiệm phục hồi tẩy trắng ánh sáng. Ngoài ra, hầu hết các kính hiển vi huỳnh quang cấp nghiên cứu được cung cấp bởi các nhà sản xuất lớn có thể dễ dàng thích ứng với các phụ kiện đồng tập trung quét laser tương ứng. Một kính hiển vi thẳng đứng chấp nhận một đơn vị quét cofocus thông qua một ống quan sát ba mắt, trong khi một thiết bị đảo ngược có thể gắn máy quét chùm tia vào cổng bên hoặc phía sau của khung kính hiển vi. Một cổng kép được chèn giữa đèn chiếu sáng thẳng đứng và ống quan sát có thể được sử dụng để đưa thêm nguồn sáng hoặc hướng huỳnh quang đến nhiều hơn một đầu dò. Hầu hết các thiết bị này đi kèm với bộ chuyển đổi gắn loại C tùy chọn hoặc phụ kiện cổng kính hiển vi tiêu chuẩn.

Kính hiển vi huỳnh quang được thiết kế để nghiên cứu điện sinh lý đã trở nên rất phức tạp. Nhiều người được trang bị các mức hấp thụ sốc chuyên dụng có thể chấp nhận các phụ kiện điều khiển vi mô khác nhau để sử dụng trong các thí nghiệm với huỳnh quang, tương phản giao thoa vi sai hồng ngoại (IR-DIC) và công nghệ hình ảnh tăng cường tương phản trường sáng truyền thống. Bàn xoay gương động vật xoay cho phép trao đổi nhanh chóng và không rung động của vật kính để ngăn chặn sự xâm nhập của mẫu vật hoặc bong bóng khi chụp ảnh tế bào và mô sống. Các quan sát vĩ mô huỳnh quang trong các sinh vật có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các ống kính macro 2x và 4x có khẩu độ số cao mới được trang bị các khối kết hợp bộ lọc chuyên dụng. Ngoài ra, một số nhà sản xuất cung cấp đèn huỳnh quang dọc và bộ lọc làm phụ kiện cho kính hiển vi stereo của họ.

Đèn chiếu sáng dọc đôi khi có thể chọn hệ số khuếch đại từ 1,25 đến 1,5 lần làm tùy chọn, nhưng do các vấn đề vốn có với việc giới thiệu khuếch đại rỗng, nên tránh sử dụng ống kính phụ để vào hình ảnh huỳnh quang càng nhiều càng tốt. Một số thiết kế chiếu sáng dọc mô-đun bao gồm các thiết bị được sử dụng để kết nối các mô-đun tách chùm có chứa nhiều cổng camera phía trên đèn chiếu sáng để tăng khả năng hình ảnh. Xem xét các phụ kiện điện khác nhau hiện có sẵn cho kính hiển vi huỳnh quang, bao gồm bàn xoay vật kính, kính tập trung, bánh xe lọc ánh sáng và nền tảng, các nhà nghiên cứu có thể tiếp cận các kỹ thuật hình ảnh phức tạp hơn bao giờ hết. Các nhà sản xuất đã đặt rất nhiều nỗ lực vào việc thiết kế phụ kiện cho nhiều ứng dụng huỳnh quang phức tạp mà trước đây chỉ có thể sử dụng kính hiển vi được xây dựng * mảnh từ nhiều nguồn khác nhau. Khi kính hiển vi huỳnh quang trở thành một công cụ ngày càng quan trọng trong sinh học tế bào, sinh lý thần kinh và lâm sàng

Thiết kế kính hiển vi huỳnh quang ngược

Các phiên bản tương tự của đèn huỳnh quang thẳng đứng có thể được sử dụng để đảo ngược giá đỡ kính hiển vi (nuôi cấy mô). Chân đế đảo ngược cũng cho phép kết hợp hoặc xen kẽ giữa các kỹ thuật tăng cường độ tương phản khác nhau để phản xạ huỳnh quang ánh sáng và kính hiển vi ánh sáng truyền qua. Kính hiển vi đảo ngược cấp nghiên cứu có nhiều cổng đầu vào/đầu ra (nhiều hơn sáu) thường có một cổng duy nhất ở mỗi bên của khung, cũng như một hoặc hai cổng ở phía sau (trên và dưới) và kính hiển vi cổng dưới cùng ở một số mô hình cho phép chụp ảnh chính đồng thời từ ba hoặc nhiều cổng mà không cần sử dụng ống kính chuyển tiếp. Mức độ kết nối này cho phép phân tích huỳnh quang phức tạp bằng cách sử dụng nhiều nguồn sáng, bánh xe lọc và hệ thống máy ảnh. Các bóng đèn thủy ngân và xenon cho kính hiển vi đảo ngược có thể được sử dụng với các ống kính đa yếu tố hoặc phi cầu tiêu chuẩn để cải thiện hiệu suất và giảm quang sai trong các vùng phổ UV và IR. Ngoài ra, một loạt các bộ điều hợp hộp đèn có thể được sử dụng để kết nối nhiều nguồn chiếu sáng, tương tự như các phụ kiện có thể được sử dụng cho kính hiển vi thẳng đứng.

Sơ đồ cấu hình của kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (nuôi cấy mô) hiện đại được trang bị cảm biến hình ảnh CCD làm mát Peltier và hệ thống máy ảnh phim 35mm truyền thống được hiển thị trong Hình 10. Mặc dù phimmáy ảnhViệc sử dụng bị hạn chế, nhưng hầu hết các kính hiển vi đảo ngược vẫn bao gồm các cổng cho các phụ kiện này ở phần dưới của đế phía trước. Kính hiển vi được hiển thị trong Hình 10 có thể sử dụng hộp đèn vonfram-halogen gắn trên thanh chống để thực hiện chiếu sáng truyền thống (có hoặc không có tăng cường độ tương phản). Đèn phóng điện hồ quang thủy ngân hoặc xenon được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang, sử dụng đèn chiếu sáng phản chiếu gắn vào cổng phía sau được cấu hình đặc biệt. Khẩu độ và khẩu độ trường, cũng như bộ lọc mật độ trung tính, đi vào gần cổng ở phía sau kính hiển vi. Trong một số mô hình kính hiển vi đảo ngược (không được hiển thị), đèn chiếu sáng phản xạ hình chữ L có thể được sử dụng để cải thiện khả năng truy cập vào cổng phụ phía sau cho các phụ kiện bổ sung. Đường dẫn ánh sáng qua kính hiển vi trong Hình 10 thể hiện ánh sáng truyền qua màu vàng, màu tím cho ánh sáng hồ quang không lọc, màu xanh lá cây cho kích thích huỳnh quang lọc và màu đỏ cho phát xạ huỳnh quang.

Khung kính hiển vi đảo ngược hiện đại, giống như đối tác thẳng đứng của chúng, là vật liệu composite được thiết kế và sản xuất bởi máy tính để ổn định cấu trúc và nhiệt. Ngoài ra, các thành phần nền tảng cơ khí và thiết kế kết cấu mạch được thiết kế với khoảng cách di chuyển ngắn và độ cứng cao để tránh cao độ và yaw khi điều khiển tay lái mục tiêu trong các hoạt động thông thường như chèn lăng kính DIC hoặc điều chỉnh vòng điều chỉnh mục tiêu. Giai đoạn khung xoay mục tiêu tiên tiến cho phép loại bỏ trôi tiêu điểm thực sự trong thời gian trễ và quan sát huỳnh quang kéo dài. Các tùy chọn sân khấu khác mà kính hiển vi thẳng đứng tiêu chuẩn không có bao gồm sân khấu xoay 360 độ và trượt, bảng điều khiển sân khấu thủy tinh, bảng sưởi, đĩa petri và khung bảng và hộp nuôi cấy carbon dioxide.

Kính hiển vi đảo ngược với thiết kế mô-đun có thể dễ dàng được cấu hình để nghiên cứu điện sinh lý, IVF, hoạt động vi mô, DIC độ phân giải cao, quan sát tăng cường video và các công nghệ huỳnh quang tiên tiến khác nhau. Những dụng cụ này cũng dễ dàng phù hợp với kính hiển vi co-focus và đa photon. Các phụ kiện điện bao gồm cửa chớp, bánh xe lọc ánh sáng, xoay bàn xoay vật kính, đĩa xoay khối huỳnh quang, trình điều khiển tập trung và gương chiếu sáng. Khi kết hợp với các đối tượng tiên tiến với khoảng cách hoạt động cao, ngâm nước, kích thích tia cực tím và tương phản pha, tất cả đều có hiệu chỉnh quang học cao và kính hiển vi đảo ngược là công cụ lý tưởng để tiến hành nghiên cứu huỳnh quang mô và tế bào sống.

kết luận

Trong kính hiển vi huỳnh quang, sự thay đổi rộng rãi giữa nồng độ của các khối huỳnh quang cục bộ trong mẫu, cùng với sự khác biệt về hệ số tuyệt chủng và năng suất lượng tử từ thuốc nhuộm huỳnh quang này sang thuốc nhuộm huỳnh quang khác, ảnh hưởng đáng kể đến tín hiệu phát xạ được tạo ra đối với cường độ kích thích định lượng. Xem xét rằng nhiều mẫu chỉ chứa một lượng nhỏ vật liệu huỳnh quang trong bất kỳ trường nhìn cụ thể nào, các yếu tố kết hợp này tạo ra mức độ phát xạ huỳnh quang trung bình nhỏ hơn 4 đến 6 bậc cường độ so với cường độ kích thích. Ngoài ra, có một số kỹ thuật huỳnh quang phức tạp hơn, chẳng hạn như lai tại chỗ và truyền năng lượng cộng hưởng (FRET), nơi cường độ tín hiệu phát ra có thể nhỏ hơn 9 đến 10 bậc cường độ so với cường độ tín hiệu phát ra được kích thích. Để bù đắp cho những khác biệt lớn giữa cường độ kích thích và cường độ phát xạ, kính hiển vi huỳnh quang hiện đại phải có khả năng làm suy giảm sự chiếu xạ kích thích hơn một tỷ lần mà không làm nhiễu tín hiệu huỳnh quang.

Một trong những tính năng chính của kính hiển vi huỳnh quang là độ đặc hiệu cao của đầu dò huỳnh quang hấp thụ và phát ra ánh sáng ở bước sóng đặc trưng, dẫn đến kỹ thuật này có thể phát hiện chọn lọc các loài vật kính ở nồng độ rất thấp trong hỗn hợp phức tạp. Ngoài ra, độ nhạy cao và độ phân giải không gian của huỳnh quang cho phép xác định chính xác và nghiên cứu các phân tử riêng lẻ ở quy mô chiều dài dưới độ phân giải quang học của kính hiển vi. Các yếu tố môi trường cục bộ cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát xạ huỳnh quang, vì vậy phương pháp này là đầu dò lý tưởng cho pH, độ nhớt, nồng độ ion, khoảng cách và định hướng phân tử, điện thế màng, kỵ nước, phân phối điện tích và biến động hệ số khuếch tán. Độ phân giải thời gian của huỳnh quang được giới hạn trong tuổi thọ của đầu dò huỳnh quang kích thích, có thể ở mức nano giây. Vì nhiều quá trình sinh học xảy ra ở miền thời gian này, động lực học phân rã có thể tiết lộ thông tin động về các quá trình tế bào. Nhìn chung, những yếu tố này rất quan trọng trong ứng dụng của hiển vi huỳnh quang vào sinh học tế bào.

Trong thập kỷ qua, kính hiển vi huỳnh quang đã phát triển với tốc độ đáng kinh ngạc, đồng thời phát triển nhanh chóng trong công nghệ laser, máy dò trạng thái rắn, sản xuất màng can thiệp và phân tích hình ảnh dựa trên máy tính. Sự phát triển của kính ngâm nước có khẩu độ cao tiếp tục hỗ trợ nghiên cứu các hiện tượng sinh học, cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện sâu các tế bào sống trong môi trường tự nhiên của chúng. Sự phát triển của các thiết bị và phụ kiện huỳnh quang tiên tiến chắc chắn sẽ tiếp tục phát triển khi các nhà sản xuất kính hiển vi đáp ứng nhu cầu thay đổi của cộng đồng nghiên cứu và đóng góp cuối cùng của chúng cho việc khám phá bí ẩn tự nhiên cuối cùng có thể có ý nghĩa sâu sắc.