Máy tổng hợp axit nucleic là thiết bị cốt lõi của sinh học phân tử, gen học và y học sinh học hiện đại, nó có thể tổng hợp các chuỗi DNA hoặc RNAoligonucleotide cụ thể một cách hiệu quả và chính xác trong ống nghiệm.Nguyên lý kỹ thuật của nó kết hợp công nghệ tổng hợp pha rắn, hóa học hữu cơ và điều khiển tự động hóa chính xác để đạt được "viết theo yêu cầu" của mã di truyền của sự sống.

　　I. Nguyên tắc cốt lõi: Phương pháp hóa học Phosphate Amine pha rắn

Công nghệ tổng hợp axit nucleic chủ đạo hiện nay đều dựa trên nguyên tắc tổng hợp pha rắn, cốt lõi của nó là phương pháp hóa học phosphat amin. Phương pháp này được đặc trưng bởi hiệu quả cao, năng suất cao và dễ dàng tự động hóa, thay thế các phương pháp diester phosphate và triester phosphate trước đó. Toàn bộ quá trình tổng hợp diễn ra bên trong cột tổng hợp của thiết bị và hướng tổng hợp của chuỗi mục tiêu là từ đầu 3'đến đầu 5'.

Một chu kỳ tổng hợp chủ yếu bao gồm bốn bước cơ bản:

1. Thoát khỏi bảo vệ:

Sự tổng hợp bắt đầu với nucleotide đầu tiên được liên kết cộng hóa trị với một chất mang pha rắn. Nhóm 5'-hydroxyl của nucleotide này được đóng bởi nhóm bảo vệ. Bước đầu tiên của chu trình là rửa sạch cột tổng hợp bằng dung dịch axit, loại bỏ nhóm bảo vệ DMT ở đầu 5'nucleotide đầu tiên, để lộ nhóm 5'-hydroxyl hoạt động để chuẩn bị cho phản ứng ghép nối tiếp theo. Cation DMT bị loại bỏ có màu cam và hiệu quả tổng hợp có thể được theo dõi trực tuyến bằng phương pháp quang phổ.

2. Kích hoạt và ghép nối:

Tiếp theo, thiết bị bơm monome nucleotide tiếp theo vào cột tổng hợp đồng thời bằng chất kích hoạt và chất kích hoạt. Bản thân nucleotide monome được kích hoạt cao, đầu 3'của nó được bảo vệ bởi nhóm amin phosphate, đầu 5'được bảo vệ bởi DMT, và cơ sở cũng có cơ sở bảo vệ tương ứng.

Các chất kích hoạt kích hoạt nhóm phosphat amin 3'của monome nucleotide, làm cho nó trở thành một tác nhân electrophilic tốt. Sau đó, nó nhanh chóng trải qua phản ứng thay thế nucleophilic với nhóm 5'-hydroxyl đã tiếp xúc trên chất mang pha rắn, tạo thành liên kết triester phosphate, do đó thêm nucleotide mới vào chuỗi oligonucleotide đang kéo dài.

3. Mũ:

Bước ghép đôi không hiệu quả 100% và luôn có một số ít các nhóm 5'-hydroxyl không tham gia vào phản ứng. Những chuỗi thất bại này, nếu không được đóng lại, sẽ tiếp tục tham gia vào phản ứng trong các chu kỳ tiếp theo, tạo ra sản phẩm phụ của chuỗi bị thiếu.

Bước "cap" sử dụng hỗn hợp chất lỏng của hai tác nhân để kết thúc acetyl hóa nhóm 5'-hydroxyl không phản ứng, vô hiệu hóa permanently của nó. Những chuỗi ngắn này được "che phủ" được loại bỏ khi chúng được tinh chế cuối cùng, làm tăng đáng kể độ chính xác và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.

4. Oxy hóa:

Bước ghép nối trước tạo thành liên kết trieste phosphate không ổn định, dễ bị phân hủy bởi axit. Bước này được thực hiện thông qua một dung dịch hỗn hợp iốt/nước/pyridin, oxy hóa nó thành liên kết triester phosphate ổn định hơn, do đó hoàn thành một chu trình bổ sung nucleotide hoàn chỉnh.

Sau đó, thiết bị tự động lặp lại bốn bước "khử bảo vệ → ghép nối → mũ → oxy hóa", mỗi chu kỳ thêm một nucleotide mới, cho đến khi toàn bộ chuỗi mục tiêu được tổng hợp hoàn tất.

　　II. Xử lý sau tổng hợp

Sau khi bộ tổng hợp axit nucleic hoàn thành việc lắp ráp chuỗi, sản phẩm thu được vẫn là một sản phẩm thô của DNA được gắn vào một chất mang pha rắn và tất cả các nhóm được bảo vệ. Vì vậy cần xử lý tiếp theo:

1. Cắt và khử bảo vệ: Sử dụng dung dịch amoniac đậm đặc để xử lý, một mặt cắt chuỗi oligonucleotide tổng hợp khỏi tàu sân bay CPG, mặt khác loại bỏ đồng bộ các nhóm bảo vệ trên tất cả các cơ sở và nhóm DMT ở cuối chuỗi.

2. Thanh lọc: Tùy thuộc vào nhu cầu ứng dụng, nó có thể được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) hoặc điện di gel polyacrylamide (PAGE), v.v. để loại bỏ chuỗi thất bại và sản phẩm phụ để có được sản phẩm cuối cùng có độ tinh khiết cao.

　　III. Tổng kết

Bản chất của máy tổng hợp axit nucleic là một lò phản ứng hóa học hữu cơ chính xác có độ tự động cao. Nó cho phép tổng hợp nhanh chóng, thông lượng cao và chính xác DNA/RNAoligonucleotide bằng cách phá vỡ các phản ứng hóa học tổng hợp phức tạp thành một loạt các bước chuẩn hóa có thể lập trình và kiểm soát chính xác tốc độ dòng chảy của chất lỏng, liều lượng thuốc thử và thời gian phản ứng bằng máy tính. Sự trưởng thành và phổ biến của công nghệ này đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển nhanh chóng của các công nghệ tiên tiến như chỉnh sửa gen, xét nghiệm PCR, thuốc axit nucleic và lưu trữ DNA.